Pozn. překl.: Autoři článku zpochybňují existenci viru HIV a poukazují na problémy hypotézy HIV/AIDS z pohledu vědců, kteří existenci ostatních virů vysloveně nezpochybňují (alespoň ji veřejně nezpochybňovali v době psaní článku). Při kritickém přezkoumání vědeckých důkazů pro existenci ostatních virů se však objevují podobné problémy jako v případě chybějících důkazů pro existenci viru HIV (viz předmluva k článku „Kde jsou vědecké důkazy existence viru HIV?“).
Eleni Papadopulos-Eleopulos1,*, Valendar F. Turner2 a John M. Papadimitriou3
1Oddělení lékařské fyziky, 2Oddělení urgentní medicíny, Royal Perth Hospital, Perth, Západní Austrálie, 3Oddělení patologie, University of Western Australia. *Korespondující autor.
V současné době se má za to, že pozitivní výsledek testu Western blot (WB) na protilátky proti viru HIV je synonymem infekce virem HIV a souvisejícího rizika vzniku AIDS. V této práci předkládáme kritické zhodnocení v současnosti dostupných údajů o izolaci viru HIV a testování protilátek. Tyto důkazy ukazují, že: (1) testy na protilátky nejsou standardizovány; (2) testy na protilátky nejsou reprodukovatelné; (3) proteiny (proužky) WB, o nichž se předpokládá, že jsou kódovány genomem viru HIV a specifické pro virus HIV, genomem viru HIV být kódovány nemusí a mohou ve skutečnosti představovat normální buněčné proteiny; (4) i kdyby byly tyto proteiny pro virus HIV specifické, tak vzhledem k tomu, že pro určení specificity nebyl použit žádný zlatý standard, pozitivní WB nemusí představovat nic jiného než zkříženou reaktivitu s protilátkami přítomnými u pacientů s AIDS a rizikových pacientů, které nejsou pro virus HIV specifické. Došli jsme k závěru, že používání testů na protilátky jako diagnostického a epidemiologického nástroje v případě infekce HIV je třeba přehodnotit.
„…nesoupeříme jen proto, aby zvítězil můj nebo váš názor, ale předpokládám, že bychom oba měli bojovat za pravdu…“
(Filebus, Platónovy dialogy)
K dnešnímu dni jsou jedinými rutinně používanými metodami k prokázání přítomnosti viru HIV in vivo testy na protilátky ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a WB (Western blot). U testu ELISA jsou proteiny přítomny jako směs a u testu WB jsou proteiny viru HIV disociovány a umístěny na polyakrylamidovou gelovou desku. Po elektroforéze jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu elektroblotováním. U testu ELISA i WB se sérum pacienta přidává k přípravku s antigeny. Předpokládá se, že pokud jsou protilátky proti viru HIV přítomny, budou reagovat s proteiny viru HIV a po promytí se vizualizují enzymatickou reakcí chromogenu proti lidskému imunoglobulinu. U testu ELISA se reakce odečítá opticky. U testu WB se jednotlivé proteiny rozpoznávají a interpretují vizuálně jako barevné proužky, z nichž každý je označen malým „p“ (jako protein), za nímž následuje číslo (což je molekulová hmotnost v kilodaltonech), například „p41“. WB je považován za test vysoce senzitivní a specifický a pozitivní výsledek je považován za synonymum infekce virem HIV. Pozitivní HIV status má tak závažné důsledky, že by nikdo neměl být nucen nést toto břemeno bez solidních záruk pravdivosti testu a jeho interpretace. V této práci je zhodnocen vývoj testů na protilátky, základy jejich specificity a validita jejich interpretace.
Přijetí testu na protilátky proti viru HIV jako vědecky platného a spolehlivého vyžaduje následující: (1) zdroj antigenů specifických pro virus HIV; (2) standardizaci; (3) stanovení reprodukovatelnosti testu. Po splnění těchto kritérií a před zavedením testů na protilátky do klinické medicíny je třeba stanovit senzitivitu, specificitu a prediktivní hodnotu testu pomocí zlatého standardu, tedy samotného viru HIV.
Proteiny považované za antigeny viru HIV
Proteiny považované za antigeny viru HIV se získávají z mitogenně stimulovaných kultur, ve kterých jsou tkáně od pacientů s AIDS kultivovány společně s buňkami získanými od pacientů bez AIDS – obvykle se jedná o stabilizované leukemické buněčné linie. Po detekci enzymu reverzní transkriptázy (RT) v kulturách se supernatant nebo častěji buněčné lyzáty odstředí v hustotních gradientech. Materiál, který vytváří v gradientu pásmo o hustotě 1,16 g/ml, je považován za „čistý virus HIV“, a proto jsou proteiny nalezené v této hustotě považovány za antigeny viru HIV. Předpokládá se, že imunogenní proteiny viru HIV jsou kódovány třemi geny, a to geny gag, pol a env. Gen gag kóduje prekurzor p53/55, který je následně štěpen na p24/25 a p17/18. Gen pol kóduje p31/32 a gen env kóduje prekurzorový protein p160, který se štěpí na p120 a p41/p45.1
Protein p120. Obecně přijímaný názor je, že p120 a p41 jsou produkty štěpení p160, který se nachází pouze v infikovaných buňkách, nikoli ve viru. Nicméně p120 je součástí pouze výběžků (hrotů) na povrchu částic viru HIV; výběžky se nacházejí jen u pučících (nezralých) částic, a nikoliv u částic mimo buňku (zralých); a nezralé částice jsou „pozorovány velmi zřídka“.2 Navzdory těmto zjištěním se při testování „purifikovaného viru HIV“ proti séru od pacientů s AIDS objeví silné proužky odpovídající p120 a p160. Tyto rozpory byly vyřešeny, když se ukázalo, že p80 (viz níže) a „složky vizualizované v oblasti 120-160 kDa neodpovídají gp120 nebo jeho prekurzoru, ale představují spíše oligomery gp41“.3
Protein p41. Protein p41 je jedním z proteinů, které Gallova i Montagnierova skupina detekovaly v prvních izolátech viru HIV. Montagnier a jeho kolegové však pozorovali, že séra od pacientů s AIDS reagovala s proteinem p41 jak v buňkách infikovaných virem HIV a virem HTLV-I, tak v buňkách neinfikovaných, a dospěli k závěru, že proužek p41 „může být způsoben kontaminací viru buněčným aktinem, který byl přítomen v imunoprecipitátech všech buněčných extraktů“.4 Přestože Gallova skupina takovou reakci s p41 v neinfikovaných buňkách nezjistila, detekovala protein p80 a dospěla k závěru, že reakce byla „nespecifická“.5
Aktin je všudypřítomný protein, který se nachází ve všech buňkách, stejně jako v bakteriích a některých virech. U dobře prozkoumaných retrovirů, jako je virus nádoru mléčné žlázy myší a virus Rousova sarkomu, bylo rovněž prokázáno, že obsahují aktin buněčného původu, a předpokládá se, že tento protein hraje klíčovou roli jak při sestavování retrovirů, tak při jejich pučení.6,7 Je také známo, že oxidace buněčných sulfhydrylových skupin, jako je tomu u pacientů s AIDS,8 souvisí se sestavováním polymerizovaného aktinu,9 a že úroveň vazby aktinových protilátek na buňky je určena fyziologickým stavem buněk. Z tohoto důvodu byla vazba aktinových protilátek na buňky navržena „jako citlivý marker pro aktivované lymfocyty“.10
Krevní destičky zdravých jedinců také obsahují protein p41/45, který reaguje se séry homosexuálních mužů s AIDS a imunitní trombocytopenickou purpurou (ITP) a který „představuje nespecifickou vazbu IgG na aktin v preparátu krevních destiček“.11
Protein p32. V roce 1987 Henderson izoloval p30-32 a p34-36 z „viru HIV purifikovaného pomocí dvojnásobného vzniku proužků“ v hustotních gradientech sacharózy. Porovnáním aminokyselinových sekvencí těchto proteinů s histokompatibilními proteiny DR II. třídy došli k závěru, že „řetězce DR alfa a beta se zdají být identické s proteiny p34-36 a p30-32“.12
Protein p24/25. V současné době se má za to, že detekce p24 je synonymem pro izolaci viru HIV a virémii. Avšak kromě společné publikace s Montagnierem, kde tvrdí, že p24 viru HIV je jedinečný, Gallo a jeho kolegové opakovaně uvedli, že p24 viru HTLV-I a viru HIV imunologicky zkříženě reagují.13
Genesca a kol.14 provedli testy WB u 100 ELISA negativních vzorků zdravých dárců krve; u 20 z nich byly zjištěny proužky viru HIV, které nesplňovaly tehdejší (1989) kritéria používaná krevními bankami pro pozitivní WB. Tyto případy byly považovány za neurčité WB (indeterminate WB – WBI), přičemž proužek p24 převažoval (70 % případů). Mezi příjemci krve s WBI bylo 36 % osob s WBI šest měsíců po transfuzi, ale stejně tak 42 % osob, které obdržely vzorky s negativním WB. Dárci i příjemci krve zůstali zdraví. Vědci došli k závěru, že vzorce WBI „jsou u náhodně vybraných dárců a příjemců mimořádně časté a tyto vzorce nekorelují s přítomností viru HIV-1 nebo přenosem viru HIV-1“, „většina takových reakcí představuje falešně pozitivní výsledky“.14
Protilátky proti p24 byly zjištěny u 1 ze 150 zdravých jedinců, u 13 % náhodně vybraných, jinak zdravých pacientů s generalizovanými bradavicemi, u 24 % pacientů s kožním lymfomem a prodromem T-lymfocytů a u 41 % pacientů s roztroušenou sklerózou.15
97 % sér homosexuálů s imunitní trombocytopenickou purpurou (ITP) a 94 % sér homosexuálů s lymfandenopatií nebo AIDS obsahuje protilátku, která reaguje s membránovým antigenem s molekulovou hmotností 25 kD nalezeným v krevních destičkách zdravých dárců a pacientů s AIDS, stejně jako s antigenem s molekulovou hmotností 25 kD nalezeným v buňkách ledvin kočkodana zeleného, v lidských kožních fibroblastech a v herpes simplex kultivovaném v buňkách opičích ledvin. Tato reakce se nevyskytovala v sérech získaných od pacientů, kteří nebyli homosexuály s ITP nebo neimunitní trombocytopenickou purpurou.11 Naopak antigen p24 se nevyskytuje u všech HIV pozitivních pacientů, nebo dokonce u pacientů s AIDS. V jedné studii byly polymerázová řetězová reakce (PCR) a p24 použity k detekci viru HIV u pacientů v různých stadiích (podle kritérií Centra pro kontrolu a prevenci nemocí – CDC) od asymptomatického stavu až po AIDS. Protein p24 byl detekován u 24 % pacientů a RNA viru HIV u 50 %.16 V jiné studii „v polovině případů, kdy měl subjekt pozitivní test na p24, měl subjekt později negativní test, aniž by užíval léky, u nichž by se dalo očekávat, že ovlivní hladinu antigenu p24… test je klinicky nevyzpytatelný a měl by být interpretován velmi opatrně“.17
Protein p17/18. Vedle proužku p24 je nejčastěji detekovaným proužkem při WB zdravých dárců krve proužek p17/18.18 Séra pacientů s AIDS se vážou na protein p18 u mitogenně stimulovaných T-lymfocytů infikovaných virem HIV, ale ne u neinfikovaných, nestimulovaných lymfocytů. Pokud jsou však lymfocyty mitogenně stimulované, ale neinfikované, séra pacientů s AIDS se na protein p18 u těchto neinfikovaných lymfocytů vážou.19
Monoklonální protilátka proti p18 viru HIV reaguje s dendritickými buňkami v lymfatických tkáních různých pacientů s řadou onemocnění nesouvisejících s AIDS20 a „stejný vzorec reaktivity byl přítomen u normální tkáně odebrané neinfikovaným jedincům, stejně jako u tkáně odebrané HIV pozitivním osobám“.21 Pacienti s AIDS a rizikoví pacienti mají vysoké hladiny protilátek proti všudypřítomnému proteinu myozinu,22 který má dvě podjednotky o molekulové hmotnosti 18 000 a 25 000.
Vzhledem k výše uvedenému je obtížné obhájit názor, že proužky p41 (a tedy p160 a p120), p32, p24 nebo p18 představují specifické proteiny viru HIV. Navíc, i kdyby se podařilo prokázat, že všechny tyto proteiny jsou pro virus HIV specifické, nelze předpokládat, že protilátky, které s nimi reagují, jsou diagnostické pro infekci virem HIV.
Standardizace testů na protilátky proti viru HIV
Test na protilátky má smysl pouze tehdy, když je standardizovaný, tj. když má daný výsledek testu stejný význam u všech pacientů, ve všech laboratořích a ve všech zemích. Z prvních reakcí antigen-protilátka, které provedly Montagnierova4 a Gallova23 skupina, vyplynulo, že ne všechny „proteiny viru HIV“ reagují se všemi séry pacientů s AIDS, nebo dokonce se séry stejných pacientů získanými v různém čase, a že séra pacientů s AIDS mohou reagovat s jinými proteiny, než které jsou považovány za antigeny viru HIV. Vzhledem k těmto různorodým reakcím bylo nezbytným požadavkem stanovit kritéria pro to, co představuje pozitivní test WB.
V roce 1987 Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) vydal licenci na soupravu WB vyráběnou společností DuPont. Souprava DuPont zůstává jedinou licencovanou soupravou WB a používá ji menšina laboratoří. Specifikuje „extrémně přísná“ kritéria pro pozitivní výsledek, a to „specifické proužky představující tři různé genové produkty: p24 (gag), p31 (pol) a proužek env, buď gp41, gp120 nebo gp160“.24
Americký červený kříž definuje pozitivní výsledek jako přítomnost protilátek proti alespoň jednomu genovému produktu z každého z genů gag, pol a env, aniž by specifikoval, o které proužky se jedná.
The Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors/Department of Defence/CDC považuje WB za pozitivní, pokud jsou reaktivní dva z p24, gp41 a gp120/160.
Konsorcium pro standardizaci sérologie retrovirů (CRSS) definuje pozitivní WB jako přítomnost protilátek minimálně proti p24 nebo p31/32 a gp41 nebo gp120/160.25
Pro všechny laboratoře je negativní výsledek podmíněn nepřítomností jakýchkoli a všech proužků včetně proužků, které nepředstavují „proteiny viru HIV“. Všechny ostatní případy, které nesplňují kritéria dané laboratoře pro pozitivní nebo negativní test, jsou touto laboratoří považovány za WBI. Ve vědecké literatuře tedy nebyly publikovány žádné proužky standardně pozitivního testu WB. Například v návodu k použití soupravy WB výrobce Bio-Rad z roku 1984, který reprodukuje „příklady typického reaktivního vzorku séra pacienta a reakce se silnou, slabou a nereaktivní kontrolou“, se rovněž uvádí: „Tento příklad ukazuje pouze typické reaktivní vzorky a nesmí se používat jako reference pro porovnání s výsledky z neznámých vzorků séra… Vzorky pacientů mohou vykazovat různý stupeň reaktivity s různými proteiny a vykazovat tak různé vzorce vývoje proužků… Každá laboratoř provádějící testování Western blot by si měla vytvořit vlastní kritéria pro interpretaci proužků. Případně může být interpretace proužků ponechána na klinickém lékaři.“ Kromě evidentních problémů spojených s nedostatečnou standardizací mají všechny výše uvedené interpretace další problémy.
Když se pro interpretaci WB použijí kritéria FDA, má pozitivní WB méně než 50 % pacientů s AIDS. Pokud se použijí kritéria CRSS, procento pacientů s AIDS s pozitivním testem se zvýší na 79 %. Ještě důležitější je, že i při použití nejpřísnějších kritérií má pozitivní WB 10 % kontrolních vzorků, které zahrnují „vzorky z center dárců krve“.25 Jak již bylo zmíněno, Henderson a kol. prokázali, že p31/32 je protein, který nenáleží viru HIV. Pinter a kol. prokázali, že p160 a p120 jsou oligomery gp41. Ukázali také, že získaný vzorec WB závisí na mnoha faktorech, včetně teploty a koncentrace dodecylsulfátu sodného použitého k narušení „čistého viru“ a došli k závěru: „Zmatek ohledně identifikace těchto proužků vedl k nesprávným závěrům v experimentálních studiích. Podobně mohly být některé klinické vzorky chybně identifikovány jako séropozitivní na základě předpokladu, že tyto proužky odrážejí specifickou reaktivitu proti dvěma odlišným virovým složkám a splňují kritérium skutečné nebo pravděpodobné pozitivity. Správná identifikace těchto proužků ovlivní standardy, které je třeba stanovit pro pozitivitu Western blotu: může si vyžádat reinterpretaci publikovaných výsledků.“ 26
Zjištění, že proužek p31/32 představuje buněčný protein a že p120 a p160 jsou oligomery p41, redukuje kritéria CRSS a Amerického červeného kříže na dva proužky, p24 a p41, které jsou podle Burkeho „méně než dokonale specifické“,27 a redukuje kritéria Association of State and Territory Public Health Laboratory Directors/Department of Defence/CDC na p24 a p41 nebo pouze p41.
Navzdory výše uvedeným důkazům se i v současnosti má za to, že proužky p160, p120 a p41 představují odlišné glykoproteiny obalu viru. Současné pokyny Světové zdravotnické organizace totiž považují sérum za pozitivní na protilátky proti viru HIV-1, pokud jsou na testovacím pásku „přítomny dva proužky obalového glykoproteinu (s nebo bez) dalších specifických virových proužků“.28
AIDS v Africe se i v současnosti definuje na základě klinických příznaků. Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) nedávno doporučilo, aby se do africké definice AIDS v budoucnu zahrnul i sérologický průkaz infekce virem HIV. Doporučeným testem je test ELISA,29 který nelze považovat za specifický. V Rusku bylo v roce 1990 z 20 000 pozitivních screeningových testů „potvrzeno pouze 112“ pomocí WB jako zlatého standardu. V roce 1991 bylo z přibližně 30 000 pozitivních screeningových testů potvrzeno pouze 66 testů.30 V Latinské Americe a v Karibiku jsou definice AIDS „klinické nálezy infekce virem HIV“ potvrzeny „testováním protilátek pomocí metod ELISA, imunofluorescence nebo Western blot“. Pro interpretaci WB nejsou uvedena žádná kritéria.31
Reprodukovatelnost
Problémy spojené s reprodukovatelností lze nejlépe ilustrovat na dvou příkladech. Obrázek č. 1 představuje testovací pásky WB vzorku séra pacienta s AIDS, který byl testován 19 laboratořemi, jež se zúčastnily druhé konference CRSS o standardizaci testu WB.25
Jak je vidět, vzor proužků získaný u jednoho a téhož séra se v jednotlivých laboratořích liší, ačkoli všechny laboratoře tento vzorek označily za pozitivní. Skupina Transfusion Safety Study (TSS) v USA předkládala každý týden přibližně 100 vzorků pacientů k testování pomocí WB třem referenčním laboratořím během tří různých období trvajících několik měsíců. Spolu se 100 vzorky pacientů předložili také alikvotní vzorky ze čtyř vzorků plazmy pro kontrolu kvality (QC), z nichž dva byly pozitivní a dva negativní. Pozitivita nebo negativita na HIV „byla založena na kolektivních zkušenostech s každým vzorkem plazmy při použití: (1) licencovaných systémů EIA pěti výrobců, (2) imunofluorescenčního testu, (3) IB ve čtyřech referenčních laboratořích a (4) radioimunoprecipitačního testu v další laboratoři“. (EIA=ELISA; IB = WB). Vzorky byly poté zaslány do referenčních laboratoří, které věděly o testování kontroly kvality, ale „označení a kódy neumožňovaly identifikaci vzorků kontroly kvality (QC) jako takových nebo souvislost s předchozími vzorky kontroly kvality“. Vzorek QC#1(+) byl 40krát zaslán do laboratoře A, 5krát do laboratoře B a 45krát do laboratoře C. Laboratoř A uvedla následující vzorce proužků: p24, p32 a gp41/120, 7krát; p24, gp41/120, 28krát; pouze p24, 5krát. Laboratoř B uvedla: p24, p32, gp41/120, 4krát; p32, gp41/120, v jednom případě. Laboratoř C uvedla: p24, p32, gp41/120, 26krát; p24, gp41/120, 10krát; p24, p32, dvakrát; pouze p24, 5krát; „ostatní“, jednou; žádný proužek, jednou.
Vzorek QC#2(+) byl zaslán celkem 89krát do tří laboratoří, které uvedly: p24, p32, gp41/120, 64krát; p24, gp41/120, 19krát; p24, p32, jednou; p32, p41/gp120, 4krát; žádný proužek, jednou.
Do tří laboratoří bylo zasláno celkem 101 alikvotních vzorků dvou negativních vzorků kontroly kvality QC#3(-) a QC#4(-). Tyto vzorky byly hlášeny následovně: žádné proužky, 67krát; „ostatní“ proužky, 13krát; pouze gp41, jednou; pouze p24, 18krát; p24, p32, gp41/120, dvakrát.
Zvláštní panel vzorků pro kontrolu kvality (QC) byl zaslán laboratořím B, C a další laboratoři D. Panel se skládal ze tří alikvotních vzorků každého z osmi vzorků, včetně šarží QC#1(+), QC#2(+), QC#3(-) a QC#4(-). Při diskusi o posledně uvedených výsledcích autoři uvedli: „Pouze zprávy laboratoře C s panelem byly v souladu s údaji získanými ze všech ostatních hodnocení reaktivity… Laboratoř B hlásila tři alikvotní vzorky QC#1(+) jako pozitivní na základě tří proužků (gp41, p55 a p65), neurčité na základě jediného proužku (gp41) a negativní (nebyl detekován žádný proužek). Kromě toho byly všechny tři alikvotní vzorky QC#6(-) považovány za neurčité, protože byl detekován pouze jeden proužek (gp41). Laboratoř D vykázala jeden alikvotní vzorek QC#6(-) jako pozitivní (p15, p24, p32, gp41, p65) a ostatní dva alikvotní vzorky jako negativní (nebyly pozorovány žádné proužky). U všech tří alikvotních vzorků QC#3(-) rovněž zaznamenala proužek p55.“ 32
Při posuzování výše uvedených výsledků je třeba mít na paměti, že byly provedeny v referenčních laboratořích, tj. prvotřídních laboratořích, které tvoří pouze malý počet z celkového počtu laboratoří, které provádějí testování pomocí WB v USA. Kromě toho mnoho laboratoří nadále používá nelicencované soupravy WB kvůli ceně a „přísným kritériím požadovaným pro interpretaci licencovaného testu“.33
Specificita testů na protilátky proti viru HIV
Úkol ověření nového diagnostického testu v klinické medicíně vyžaduje alternativní, nezávislou metodu, jak zjistit přítomnost stavu, pro který má být test použit. Tato metoda, často označovaná jako zlatý standard, je zásadní podmínkou sine qua non a představuje princip, na němž spočívá vědecký důkaz platnosti. Jediným možným zlatým standardem pro testy na protilátky proti viru HIV je samotný virus lidské imunodeficience. Klinický syndrom a snížení počtu T4-lymfocytů nelze považovat za zlatý standard. Přestože virus HIV nebyl jako zlatý standard nikdy použit, panuje všeobecný konsensus, že důkaz specificity testů na protilátky proti viru HIV byl jasně prokázán. Pro test ELISA byly nejlepší Gallovy údaje získané od pacientů s AIDS a 297 zdravých dárců krve 97,7% senzitivita a 92,6% specificita za předpokladu, že hraniční testy jsou pozitivní a za použití klinického syndromu jako zlatého standardu.34
Burke a kol. z Walter Reed Army Institute v USA jsou považováni za ty, kteří nejdůkladněji prozkoumali problém definování specificity protilátek proti viru HIV ve velké populaci, a obecně se má za to, že jejich údaje odpovídají současným poznatkům.35 Burke a kol.36 testovali úzce selektovanou zdravou subpopulaci 135 187 jedinců vybraných pro velmi nízkou prevalenci HIV infekce – 1/10 z mnohem většího souboru uchazečů (1,2 milionu) o vojenskou službu v USA. Všichni uchazeči byli vyšetřeni úvodním testem ELISA a všechny reaktivní testy ELISA byly zopakovány. Byl proveden úvodní test WB a v případě diagnostiky nebo reaktivity byl proveden druhý WB na jiném vzorku čerstvé krve. Původně byly kritérii pro pozitivní a diagnostický WB „přítomnost proužku 41 kD, kombinace proužků 24 a 55 kD nebo obojí. Od května 1987 byla metoda přípravy blotovacích pásků upravena tak, aby bylo možné reprodukovatelně detekovat protilátky proti gp120 a gp160, a kritéria pro reaktivní a diagnostický blotovací vzor byla změněna na kritéria Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors.“ Pozitivní WB byl diagnostikován tehdy a pouze tehdy, pokud první a druhý vzorek séra byly diagnostické při WB. Všechny diagnostické vzorky WB byly poté vyšetřeny pomocí čtyř dalších testů na protilátky. WB byl považován za „skutečně pozitivní, pokud všechny čtyři testy na všech dostupných vzorcích séra uchazeče byly reaktivní a diagnostické,“ ale WB byl považován za „falešně pozitivní, pokud všechny čtyři testy na všech dostupných vzorcích séra uchazeče byly nereaktivní, nediagnostické nebo obojí.“ Ze 135 187 uchazečů bylo 16 testů pozitivních. V jednom případě nebylo sérum k dispozici pro další testování a jeden uchazeč odmítl poskytnout druhý vzorek. Sérum z 27 z 29 vzorků od 15 uchazečů, které byly shledány pozitivními, bylo testováno dalšími čtyřmi testy na protilátky. Čtrnáct vzorků bylo shledáno pozitivními všemi čtyřmi testy a všechny čtyři testy byly u jednoho žadatele negativní. Z toho Burke a jeho spolupracovníci vypočítali míru falešně pozitivních výsledků jako 1 z 135 187, tj. 0,0007 %.
Spekulovali také o důsledcích, které by tyto údaje mohly mít pro celou jejich populaci 1,2 milionu uchazečů. Vypočítali celkovou prevalenci 1,48 na 1000 v celé skupině, což odpovídá 200 na 135 187. Za předpokladu, že míra falešně pozitivních testů je v celé populaci stejná, odhadli, že jelikož na 135 187 osob připadne 200 skutečně pozitivních testů, z nichž pouze jeden bude falešně pozitivní, pak „prediktivní hodnota pozitivní diagnózy v tomto programu je 99,5 %“ se „specificitou zhruba 99,9993 %“.35,36 Mnohé z těchto úvah je možné kritizovat: (1) Neexistuje žádný zlatý standard pro definici infekce virem HIV. Testování pozitivního WB u zbývajících 15 uchazečů na základě čtyř dalších testů na protilátky neumožňuje nezávislé stanovení „skutečné“ infekce virem HIV, protože se jedná o stejný test. (2) Skutečně pozitivní vzorky definují jako vzorky, které opakovaně vykazují pozitivní výsledky ve čtyřech podobných testech, a falešně pozitivní testy jako vzorky, které opakovaně vykazují negativní výsledky ve čtyřech podobných testech. Počet testovaných vzorků a opakování je libovolný. Nebylo by možné říci, jaký by byl výsledek, kdyby např. testy ELISA byly zopakovány třikrát místo dvakrát, nebo kdyby vzorky, které byly při prvním testu ELISA negativní, byly znovu testovány jiným testem ELISA nebo WB. Existují dobře zdokumentované zprávy, ve kterých je test ELISA negativní a test WB pozitivní.37 Dále definují míru falešně pozitivních výsledků jako počet falešně pozitivních výsledků dělený počtem testovaných vzorků. Tyto definice se vůbec nepodobají definicím popsaným ve standardních textech.38 Správné definice jsou: Pravdivě pozitivní test je pozitivní test u jedince, který je infikován virem HIV podle nezávislého zlatého standardu; falešně pozitivní test je pozitivní test u jedince, který podle zlatého standardu není infikován virem HIV (ale nemusí být nutně zdravý), a míra falešné pozitivity je pravděpodobnost, že test bude pozitivní, i když infekce virem HIV, jak je stanoveno nezávislým zlatým standardem, není přítomna (bez onemocnění).
Dále jsou předpoklady Burkeho a kol. zcela opačné než předpoklady Galla a kol., kde jsou všechny pozitivní výsledky testů u zdravých jedinců považovány za falešně pozitivní. Na základě předpokladů Galla a jeho spolupracovníků musíme všech 16 případů považovat za falešně pozitivní, protože neexistuje žádný pádný důvod považovat zdravé uchazeče o vojenskou službu za významně odlišné od zdravých dárců krve. Navíc extrapolace na všech 1,2 milionu uchazečů je neplatná. Tuto extrapolaci lze provést pouze v případě, že 135 187 uchazečů bylo náhodně vybráno z celého souboru, což se nestalo. Kromě toho k jimi uváděnému číslu 99,5% pozitivní prediktivní hodnoty nelze dospět bez znalosti senzitivity testu WB a prevalence skutečné HIV infekce,38 a to ani v případě, že by specificita a extrapolace byly správné.
A konečně, pomocí algoritmu použitého Burkem a jeho spolupracovníky nelze definovat specificitu, senzitivitu a prediktivní hodnotu. To nejlepší, co mohou se svým algoritmem udělat, je určit reprodukovatelnost testů ELISA a WB. V tomto ohledu bylo v rozsáhlejší studii 1,2 milionu zdravých uchazečů o vojenskou službu přibližně 1 % všech počátečních testů ELISA pozitivních, z nichž 50 % bylo následně negativních; 30-40 % prvních WB bylo pozitivních a 96 % druhých WB bylo pozitivních. Jinými slovy, Burkeho větší studie odhaluje 6 000 jedinců s původně pozitivním, ale následně negativním testem ELISA, 4 000 jedinců se dvěma pozitivními testy ELISA a následným negativním testem WB a 80 jedinců se dvěma pozitivními testy ELISA, původně pozitivním WB a negativním opakovaným WB.
To nelze považovat za triviální problém, protože několik tisíc zdravých jedinců má protilátky, které reagují s „proteiny viru HIV“, ale kteří nakonec nejsou považováni za infikované virem HIV. I v těch nejlepších laboratořích by bylo Burkeho 80 zdravých uchazečů diagnostikováno jako infikovaní virem HIV, protože se provádí pouze jeden WB.
Problém se stává ještě závažnějším, když si uvědomíme, že v září 1987 (v té době už byl na základě testů na protilátky obecně přijímán kauzální vztah mezi virem HIV a AIDS) stačil k potvrzení infekce virem HIV jediný pozitivní test ELISA nebo pozitivní WB, jeden proužek (buď p24, nebo p41). V současné době panuje obecný názor, že testy ELISA mají „senzitivitu a specificitu přes 98 %, přičemž mnohé se blíží 100 %“,24 a definice AIDS Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) „akceptuje reaktivní screeningový test na protilátky proti viru HIV bez potvrzení dodatečným testem, protože opakovaně reaktivní výsledek screeningového testu v kombinaci s indikátorovým onemocněním je vysoce indikativní pro skutečné onemocnění virem HIV“ 39 (screeningový test = ELISA).
Burke a kol., stejně jako Gallo a kol., stanovili specificitu bez ohledu na nemocné jedince. Definice specificity vyžaduje, aby test byl hodnocen u osob, které nemají onemocnění, které je předmětem zkoumání, včetně nemocných jedinců, kteří mají jiná onemocnění, při nichž mohou být z jiných důvodů produkovány protilátky, z nichž některé mohou interagovat s antigeny viru HIV. Specificita testů na protilátky proti viru HIV musí být stanovena testováním osob, které jsou imunosuprimované a/nebo mají příznaky a klinické projevy podobné AIDS, ale nejsou považovány za osoby s AIDS nebo infekcí virem HIV. Tento bod dobře ilustrují sérologické testy na syfilidu. U zdravé osoby, která není infikována bakterií Treponema pallidum, by byl test velmi zřídka pozitivní (falešně pozitivní). Několik autorů však potvrzuje přítomnost biologicky falešně pozitivních testů na syfilidu (BFPS) u různých nesouvisejících onemocnění, které se mohou vyskytovat u pacientů s autoimunitní hemolytickou anémií, systémovým lupus erythematodes (SLE), idiopatickou trombocytopenickou purpurou, leprou a u drogově závislých. Více než 20 % drogově závislých má pozitivní testy a je u nich nejvyšší výskyt BFPS.40 U osob s BFPS byla rovněž zjištěna „vysoká frekvence dalších sérologických abnormalit včetně antinukleárních faktorů, autoprotilátek a změn gama globulinu“. To vedlo vědce k závěru, že „reakce BFP je často markerem neidentifikované poruchy imunitního systému, která predisponuje k autoimunitním onemocněním“.40 Významné je, že u vysokého podílu (14 %) pacientů s AIDS byla zjištěna také falešně pozitivní sérologie na syfilidu.41
Přinejmenším dvě skupiny výzkumníků upozornily na možnost, že test na protilátky proti viru HIV u Afričanů a intravenózních uživatelů drog může být také reakcí BFP. Jaffe a kol.42 testovali 1 129 vzorků séra od intravenózních uživatelů drog a 89 kontrolních vzorků od osob, které drogy neužívaly. Všechny vzorky byly odebrány v letech 1971-1972 a testovány dvěma komerčními testy ELISA a WB. Pozitivními bylo shledáno 17 vzorků od intravenózních uživatelů drog, ale ani jeden vzorek kontrolní. Vědci došli k závěru: „Na základě našich údajů o pozitivním Western blotu se zdá, že parenterální uživatelé drog mohli být vystaveni viru HTLV-III nebo příbuznému viru již v roce 1971. Alternativním, ale stejně reálným vysvětlením je, že séropozitivita v případě viru HTLV-III zjištěná u těchto vzorků představuje falešně pozitivní nebo nespecifické reakce.“ Biggar a kol.43 zjistili, že u zdravých Afričanů se pravděpodobnost nálezu pozitivního testu na protilátky proti viru HIV významně zvyšuje se zvyšující se hladinou imunokomplexu. Dospěli k závěru, že „reaktivita u testů ELISA i Western Blot může být u Afričanů nespecifická… příčinu této nespecificity je třeba objasnit, aby bylo možné určit, jak mohou ovlivnit séroepidemiologii retrovirů v jiných oblastech než v Africe, například v Karibiku a Japonsku.“
To, že pozitivní WB u všech jedinců může představovat reakci BFP, naznačují důkazy jak z retrovirologie obecně, tak zejména z testování protilátek proti viru HIV. Je známo, že všechny protilátky včetně monoklonálních protilátek jsou schopny reagovat s imunizujícími antigeny, stejně jako s jinými vlastními i nevlastními složkami.44,45 V souvislosti s retroviry se ve vědecké literatuře objevuje mnoho údajů, které ukazují na častou přítomnost nespecifických interakcí mezi antigeny retrovirů a nepříbuznými protilátkami. Velká část těchto prací se objevila jako výsledek hledání virového původu zvířecích a lidských novotvarů.46,51
U drogově závislých existuje významná souvislost mezi vysokou hladinou globulinů v séru a pozitivním testem na protilátky proti viru HIV a tato „proměnná byla jedinou proměnnou, která zůstala významná v logistickém regresním modelu“.52 U dětí byla při použití WB jako zlatého standardu hyperglobulinémie identifikována u dětí infikovaných virem HIV se specificitou 97 %.53 Šedesát tři sér získaných od 23 pacientů před a bezprostředně po infuzi imunoglobulinů bylo testováno na protilátky proti viru HIV pomocí WB. Z 63 sér bylo 52 (83 %) pozitivních. „Několik vzorků testovaných radioimunoanalýzou na p24 viru HTLV-III bylo rovněž pozitivních. Množství zjištěných protilátek bylo největší bezprostředně po infuzi a mezi infuzemi klesalo.“ 54 Jedinci bylo podáno šest 5ml injekcí darovaného Rh+ séra, podávaných ve čtyřdenních intervalech. „Sérum dárce bylo při testu ELISA negativní na protilátky proti viru HIV a antigen viru HIV, stejně jako krev odebraná jeho manželce a dítěti.“ „Krev odebraná po první imunizaci byla v testech ELISA a WB negativní na protilátky proti viru HIV. Po druhé imunizaci byl sledován slabý signál v testu ELISA, mírně nad hraniční hodnotou. Po třetí imunizaci byl signál silný a WB odhalil zřetelné interakce s proteiny p17 a p55. Ještě silnější signál byl sledován po páté imunizaci. Interakce s proteiny p17, p31, gp41, p55 a některými dalšími proteiny byla evidentní.“ 55
Vzhledem k tomu, že jedinci z hlavních rizikových skupin AIDS, tj. homosexuální muži, uživatelé drog a hemofilici, jsou vystaveni mnoha cizorodým látkám, jako je sperma, drogy, faktor VIII, krev a krevní složky, a u jedinců patřících do výše uvedených skupin se běžně vyskytují infekce nesouvisející s virem HIV, dalo by se očekávat, že tito jedinci budou mít vysoké hladiny protilátek proti jiným antigenům než antigenům viru HIV. Ve skutečnosti mají jedinci s AIDS, s komplexem souvisejícím s AIDS (ARC) a rizikoví jedinci cirkulující imunitní komplexy, revmatoidní faktor, antinukleární faktor, protilátky proti kardiolipinu, proti krevním destičkám, červeným krvinkám, buňkám, aktinu, DNA, tubulinu, thyroglobulinu, albuminu, myozinu, trinitrofenylu a proti thymosinu.22,56 Autoprotilátky proti lymfocytům byly zjištěny u 87 % HIV+ pacientů a jejich hladiny korelují s klinickým stavem.57,58 Na rozdíl od normálních sér bylo 37 % HIV+ sér pozitivních na retroviry typu D,59 zatímco virus HIV je považován za lentivirus.
Je také známo, že sérové hladiny IgG jsou vyšší u afroamerických dárců krve než u bělochů,60 že některé rizikové skupiny, uživatelé drog a homosexuální muži jsou vystaveni vysokým hladinám mitogenních látek, spermatu a dusitanů,61,62 a že u zvířat, kterým byly takové látky podány, se vytvářejí protilátky, které reagují s retrovirovými antigeny.63 To, že pozitivní test na protilátky proti viru HIV může být výsledkem jiné antigenní stimulace než stimulace virem HIV, podporují i následující údaje: (1) předpokládá se, že virus HIV se přenáší infikovanými jehlami, přesto je pozitivní test u většího procenta prostitutek, které užívají drogy orálně (84 %), než intravenózně (46 %).64 (2) „Myši autoimunitních kmenů MRL-lpr/lpr a MRL-+/+ vytvářely protilátky proti gp120.“ Ukázalo se, že myši, které byly vystaveny T-lymfocytům jiného kmene myší, vytvářejí protilátky proti gp120 a p24 viru HIV.65 (3) U příjemců negativní krve dochází k sérokonverzi a rozvoji AIDS, zatímco dárci zůstávají zdraví a séronegativní.66 (4) U zdravých jedinců, partnerů HIV pozitivních jedinců, příjemců transplantovaných orgánů a pacientů se SLE se může pozitivní WB změnit na negativní při expozici spermatu, imunosupresivní terapii nebo klinickém zlepšení.67-69 (5) Zatímco frekvence pozitivních testů na protilátky proti viru HIV u zdravých dárců krve a vojenských uchazečů je nízká, u pacientů s tuberkulózou (TBC), včetně pacientů s TBC lokalizovanou v plicích, jak v USA,70 tak v Africe,71 je frekvence pozitivních WB vysoká, až 50 %. V USA72 (26 sledovaných nemocnic) mají pacienti, u nichž nehrozí riziko vzniku AIDS a kteří nemají žádné infekční onemocnění, vysokou frekvenci pozitivních WB (1,3 % až 7,8 %). Výše uvedené údaje lze interpretovat buď jako důkaz, že virus HIV se šíří i v heterosexuální populaci, nebo že testy na protilátky proti viru HIV jsou nespecifické. Tomu, že jde o druhou možnost, nasvědčuje skutečnost, že v roce 1988 bylo v USA hlášeno pouze přibližně 66 mužů bělochů, kteří měli „heterosexuálně získaný AIDS“.73 V roce 1992 bylo v New Yorku hlášeno pouze 11 mužů, kteří měli AIDS v důsledku heterosexuální infekce.74
Rodriguez a kol.75 zjistili, že u amazonských indiánů, kteří nemají kontakt s osobami mimo svůj kmen a nemají AIDS, je míra HIV séropozitivity při testu WB 3,3 % až 13,3 % v závislosti na studovaném kmeni. V jiné studii76 zjistili, že 25 % až 41 % venezuelských pacientů s malárií mělo pozitivní WB, ale nemělo AIDS. Výše uvedené údaje znamenají, že buď virus HIV nezpůsobuje AIDS „ani v přítomnosti závažných imunoregulačních poruch charakteristických pro akutní malárii“, (závěr, ke kterému došli Rodriguez a kol.), nebo jsou testy na protilátky proti viru HIV nespecifické.
Problémům spojeným se specificitou WB by se dalo předejít použitím jediného vhodného zlatého standardu, kterým je izolace viru HIV. To dosud nebylo provedeno a na základě problémů spojených s izolací viru HIV to možná ani není proveditelné.
Izolace viru HIV
Izolace viru může být použita jako zlatý standard pouze tehdy, pokud poskytne přesvědčivé genetické, virologické a molekulární důkazy o existenci specifického viru. U retrovirů je třeba jako první krok k tomuto cíli nalézt částice s morfologickými charakteristikami podobnými jiným retrovirům a prokázat, že tyto částice mají specifický soubor strukturních složek včetně RNA a proteinů, které patří pouze těmto částicím a žádné jiné entitě.
Peyton Rous77 se zasloužil o objev a izolaci prvního retroviru. V roce 1911 se mu podařilo opakovaně vyvolat nádory u určitého plemene kuřat pomocí filtrátů bez buněk získaných z nádorů. Rous předpokládal, že základem jeho pozorování může být buď „drobný parazitický organismus“, nebo „chemický stimulant“; nicméně filtráty vyvolávající nádory se staly známými jako „filtrovatelné viry“ nebo onkoviry. V 50. letech 20. století byly ve zvířecích kulturách a v čerstvé tkáni, zejména nádorové, zjištěny pomocí elektronové mikroskopie snadno detekovatelné částice později připisované retrovirům. V roce 1970 byl u onkovirů objeven enzym reverzní transkriptáza (RT), který přepisuje RNA do DNA. Z tohoto důvodu se v 70. letech 20. století začalo onkovirům říkat retroviry. V předchozím desetiletí se začala používat centrifugace v hustotním gradientu k separaci a izolaci subcelulárních částic včetně virů. Jelikož bylo zjištěno, že některé buněčné složky mají stejnou hustotu jako viry, když byly viry izolovány z buněčných kultur, nejlepších výsledků bylo možné dosáhnout s tekutinami supernatantu, které měly vysokou koncentraci virů a málo buněčných kontaminantů. Tomu nejlépe vyhovovaly viry, které nevyvolávají cytopatický efekt, a kultivační podmínky, které udržovaly maximální životaschopnost buněk. Většina retrovirů (výjimku tvoří tzv. viry zvířecí imunodeficience) výše uvedené podmínky splňuje. S využitím výše uvedených vlastností retrovirů se pomocí opakovaných suspenzí a sedimentací v hustotních gradientech sacharózy podařilo při hustotě 1,16 g/ml získat relativně čistou koncentraci retrovirových částic – to znamená získat částice oddělené od všeho ostatního, a tak je izolovat.78 Nicméně, jak upozorňují mnozí významní retrovirologové, nebylo možné se vyhnout kontaminaci virového preparátu částicemi podobnými virům, které obsahují RT a které mohly být pouhými „buněčnými fragmenty“, mikrozomy z narušených buněk, „membránovými vezikuly, které mohou obsahovat jiné buněčné složky včetně nukleových kyselin“, zejména když byla vyvolána „neúmyslná lýza buněk“.79-81 Z tohoto důvodu, aby se prokázalo, že materiál, který v hustotním gradientu sacharózy vytvářel pásmo o hustotě 1,16 g/ml, neobsahoval nic jiného než částice „bez zjevných rozdílů ve fyzickém vzhledu“ a že částice byly skutečně retroviry, byl každý preparát s retroviry dále analyzován pomocí elektronové mikroskopie na množství virů, morfologii a čistotu; dále na aktivitu reverzní transkriptázy (RT), virovou a buněčnou RNA, celkový protein, gelovou analýzu virových a hostitelských proteinů a nukleových kyselin pro stanovení biochemických kritérií a vzorky byly biologicky testovány na infekčnost in vivo a in vitro.78,82
Ve většině kultur retrovirů je koncentrace částic poměrně vysoká (104-105 infekčních jednotek/ml), ale v primárních kulturách/kokulturách vzorků od pacientů s AIDS je koncentrace částic tak nízká, že Gallova i Montagnierova skupina měly potíže s jejich detekcí. Na rozdíl od jiných zvířecích retrovirů se má za to, že virus HIV vyvolává cytopatický efekt. Pokud tomu tak je, pak supernatanty buněčných kultur budou obsahovat mnoho buněčných složek. Dále, pokud, jak bylo nedávno navrženo, „jediný unikátní mechanismus“, apoptóza indukovaná virem HIV, může vysvětlit buněčnou smrt T4-lymfocytů,83 pak supernatant musí také obsahovat apoptotická tělíska, tj. buněčné fragmenty odvozené z plazmatické membrány, které (stejně jako mnoho retrovirů) pučí z povrchu buněk. Vzhledem k tomu, že velikost a složení (některá obsahují pyknotický chromatin) apoptotických tělísek se značně liší,84 lze očekávat, že některé z těchto fragmentů budou v hustotním gradientu sacharózy rovněž vytvářet pásmo o hustotě 1,16 g/ml. Důležité je, že kultury/kokultury vzorků od pacientů s AIDS nemají maximální životaschopnost a většina, ne-li všechna tvrzení o „izolaci viru HIV“ byla z buněčných lyzátů. A co je nejdůležitější, rozsáhlá rešerše literatury o AIDS neodhalila žádné elektronové mikrofotografie materiálu, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml. Na všech snímcích z elektronového mikroskopu jsou částice nalezené v buněčných kulturách. Není tedy možné zjistit, zda materiál, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml („čisté částice viru HIV“), vůbec nějaké takové částice obsahuje, a pokud jsou přítomny, jaká je jejich čistota.
Dostupné důkazy ve skutečnosti naznačují, že pouze asi 20 % proteinů, které v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml, jsou „proteiny viru HIV“, zbytek jsou buněčné proteiny, včetně beta-2 mikroglobulinu a proteinů HLA-DR (4,4 %).12,85 I když jsou tedy částice v pásmu o hustotě 1,16 g/ml přítomny a všechny proteiny, o nichž se předpokládá, že jsou proteiny viru HIV, jsou v částicích viru HIV obsaženy, pak materiál, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml, nelze považovat za „čistý virus HIV“. Naopak: „Velká část virových proteinů vylučovaných z buněk infikovaných virem HIV nepochází z částic a podíl (například) p24 ve virionech je funkcí virového genotypu a stáří kultury. V extrémních případech se ve virionech nachází méně než 1 % z celkového množství p24 a gp120 přítomných [v kultuře].“ 86 Ve skutečnosti se p24 uvolňuje z „infikovaných buněk nezávisle na infekčních částicích viru“ a RT.87,88
Je třeba zdůraznit, že termíny v literatuře o AIDS jako „HIV“, „izolace viru HIV“, „čisté částice“, „virové částice“, „viriony“ a „infekční částice“ mají různé významy a zahrnují všechny níže uvedené, ale většinou bez důkazu přítomnosti částice: „RNA obalená proteinem“,89 materiál ze supernatantů buněčných kultur, který projde přes filtry nepropustné pro buňky, ale přes který mohou procházet organismy, jako jsou mykoplazmata,90 pelety získané prostou ultracentrifugací supernatantu kultury91 a v poslední době velmi často detekce p24 v kulturách se vzorky od pacientů s AIDS.92,93
V první zprávě o „izolaci viru HIV“ zjistila Montagnierova skupina v mitogenně stimulované kultuře získané z biopsie lymfatické uzliny homosexuála s lymfadenopatií „přechodnou“ „aktivitu reverzní transkriptázy (RT)“. V mitogenně stimulovaných lymfocytech z pupečníku kultivovaných se supernatantem z výše uvedených kultur zaznamenali retrovirové částice typu C (RVP) v kulturách a RT a antigeny, které reagovaly s pre-AIDS séry v materiálu, který v hustotním gradientu sacharózy vytvářel pásmo o hustotě 1,16 g/ml.4 Gallova skupina nepovažovala detekci výše uvedeného za „skutečnou izolaci“, „…virus nebyl přenesen na trvale rostoucí buněčnou linii pro skutečnou izolaci, a proto bylo obtížné jej získat v množství“.94 Ale přestože Gallova skupina použila k „izolaci viru HIV“ trvalou buněčnou linii, nezaznamenala nic jiného než stejné jevy jako Montagnierova skupina. Přesto se v současné době považuje detekce výše uvedených jevů za „skutečnou izolaci“ a jejich nález v podobné kultuře se považuje za důkaz infekčnosti. Izolace je však definována jako oddělení viru od všeho ostatního, a nikoliv detekce některých jevů, které jsou mu přisuzovány (RT, reakce protilátek/antigenů [WB]) nebo které jsou mu podobné (částice). Takové jevy mohou být použity pouze pro detekci viru, a to pouze tehdy, pokud bylo prokázáno, že jsou pro virus specifické.
Reverzní transkriptáza. Při všech výzkumech viru HIV se za důkaz aktivity reverzní transkriptázy (RT) viru HIV považuje kopírování templátu-primeru An.dT15 při inkubaci se supernatantem nebo materiálem, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml, z kultur/kokultur od pacientů s AIDS. V mnoha případech se tato aktivita považuje za synonymum „izolace viru HIV“ a používá se ke kvantifikaci viru. Stejný templát-primer je však kopírován také při inkubaci s materiálem, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml, a pochází z kultur leukemických T-lymfocytů95 a normálních neinfikovaných spermií.96 Jak An.dT15, tak Cn.dG15 jsou kopírovány materiálem, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml a pochází z normálních, neinfikovaných, ale mitogenně stimulovaných lymfocytů95,97 a An.dT15 je kopírován nejen reverzní transkriptázou (RT), ale také dvěma (beta a gama) ze tří buněčných DNA polymeráz. Ve skutečnosti byla v roce 1975 na Mezinárodní konferenci o eukaryotických DNA polymerázách definována DNA polymeráza gama jako buněčný enzym, který „kopíruje An.dT15 s vysokou účinností, ale nekopíruje DNA dobře“.98 Kopírování templátu-primeru An.dT15 tedy nelze považovat za synonymum přítomnosti RT viru HIV.
Detekce částic. Retroviry jsou obalené infekční částice o průměru asi 100-120 nm obsahující proteinový obal a ribonukleoproteinový komplex. Retroviry jsou klasifikovány do tří podčeledí – Spumavirinae, Lentivirinae a Oncovirinae. Retroviry patřící do posledně jmenované podčeledi se dělí na částice typu A, B, C a D. Někteří z nejznámějších retrovirologů však nepovažují nález „virům podobných částic, které morfologicky a biochemicky připomínají“ retroviry, za důkaz existence těchto virů.99 V 70. letech 20. století byly takové částice často pozorovány v lidských leukemických tkáních,99 v kulturách embryonálních tkání100,101 a „ve většině, ne-li ve všech, lidských placentách“.102
Částice detekované v kulturách/kokulturách od pacientů s AIDS jsou všemi výzkumníky AIDS považovány za částice viru HIV. Neexistuje však shoda v tom, do kterého rodu, nebo dokonce podčeledi retrovirů patří. Někdy není shoda nalezena ani v rámci jedné laboratoře. Například Montagnierova skupina původně uváděla virus HIV jako onkovirus typu C,4 poté jako onkovirus typu D104 a následně to, že patří do jiné podčeledi retrovirů – Lentivirinae.105 Navíc se „částice viru HIV“ v monocytech liší jak od onkovirů typu C, tak od lentivirů.106
Gelderblom a kol. předložili model viru HIV (obr. 2), který má dobře definovanou morfologii a složení, včetně povrchových výběžků tvořených proteinem p120, který je považován za klíčový v cytopatogenezi a nezbytný pro infekčnost viru HIV.107 Tento model byl přijat a je dobře znám. Stejná skupina však pomocí elektronové mikroskopie a protilátek ukázala, že výběžky se nacházejí pouze u nezralých (pučících) částic, které jsou „velmi zřídka pozorovány“ a jsou vidět pouze „na metabolicky poškozených buňkách“ 2,108 a že zralé částice jsou „stěží, pokud vůbec, značeny“ séry od pacientů s AIDS a ARC. Nezralé částice jsou „výrazně značeny“, ale stejně tak i zbytek buňky, ze které pučí, což „může být způsobeno tím, že přirozená imunní séra jsou ve skutečnosti polyspecifická“ 2,109 a stejně jako séra reagují protilátky proti p120 přednostně s nezralými částicemi.107 Monoklonální protilátky proti gag proteinům značí zralé částice, ale také částice viru HIV-2 a částice viru opičí imunodeficience.110 V částicích viru HIV, včetně jeho membrány, detekovali111 (stejně jako jiní112) mnoho buněčných proteinů, ale s možnou výjimkou „laterálních tělísek“ nejsou tyto proteiny v idealizovaném modelu viru HIV zahrnuty.
Kultury T-lymfocytů a monocytů „infikované virem HIV“ obsahují kromě částic s morfologií přisuzovanou viru HIV i mnoho dalších „virových částic“, které se žádným „částicím viru HIV“ nepodobají.106,111,113,114 Buňky H9 neinfikované virem HIV, z nichž pochází většina publikovaných snímků z elektronového mikroskopu, stejně jako další buňky používané pro „izolaci viru HIV“, CEM, C8166, EBV transformované B-lymfocyty a lymfocyty pupečníkové krve, exprimují pučící částice podobné virům, i když se od částic přijímaných jako částice viru HIV poněkud liší.115 Výše uvedené údaje vyvolávají otázky týkající se původu a úlohy jak „částic, které nejsou částicemi viru HIV“, tak „částic viru HIV“, a otázky, které z těchto částic vytvářejí v hustotním gradientu sacharózy pásmo o hustotě 1,16 g/ml. Pučící a zralé částice typu C se objevují v metabolicky poškozených buňkách lymfomu, které však nejsou infikovány virem HIV116 a „částice retrovirů“ antigenně příbuzné s virem HIV byly nalezeny v kulturách extraktů slinných žláz od pacientů se Sjögrenovým syndromem.117
Nezávislý nález „virům podobných“ částic v lymfatických uzlinách pacientů s AIDS s lymfadenopatií118 a proteinů v lymfatických uzlinách, které reagovaly s monoklonálními protilátkami proti p55, p24 a p18,119 byl interpretován jako důkaz toho, že „virům podobné částice“ byly částicemi viru HIV. Monoklonální protilátky proti p18 však reagují s lymfatickými tkáněmi pacientů, kteří trpí řadou onemocnění nesouvisejících s AIDS, a také zdravých jedinců.20,21 V lymfatických uzlinách pacientů s přetrvávající generalizovanou lymfadenopatií související s AIDS byly kromě „částic viru HIV“ nalezeny i částice odlišné od částic viru HIV120 a co je nejdůležitější, v jediné elektronmikroskopické studii,121 ať už in vivo nebo in vitro, v níž byly použity vhodné kontroly a v níž bylo provedeno rozsáhlé zaslepené zkoumání kontrol a testovaného materiálu, byly v různých reaktivních lymfadenopatiích nesouvisejících s virem HIV nalezeny částice nerozlišitelné od viru HIV, což vedlo autory k závěru: „Přítomnost takových částic sama o sobě infekci virem HIV neindikuje.“
Komentáře k „izolaci“. Buněčnou linií nejčastěji používanou ve výzkumu AIDS je leukemická buněčná linie H9. H9 je klonem buněčné linie HUT78, která byla získána od pacienta s leukémií dospělých T-lymfocytů. Vzhledem k tomu, že za původce této leukémie je považován virus HTLV-I, další exogenní retrovirus, měly by kultury H9 obsahovat jak reverzní transkriptázu (RT), tak částice retrovirů i za nepřítomnosti viru HIV. Protože asi 25 % pacientů s AIDS má protilátky proti HTLV-I,51 asi 25 % kultur by mělo mít kromě částic a RT také pozitivní WB na HTLV-I. Jelikož však proteiny viru HIV a viru HTLV-I mají stejnou molekulovou hmotnost, budou se proužky viru HTLV-I při WB jevit jako pozitivní na virus HIV.
Dalším evidentním problémem spojeným s používáním „izolace viru HIV“ jako zlatého standardu je skutečnost, že bez ohledu na různé jevy, které výzkumníci AIDS považují za „izolaci viru HIV“, a navzdory vynaloženému úsilí není možné „virus HIV izolovat“ od všech pacientů s pozitivními protilátkami. Míra úspěšnosti se pohybuje mezi 17 % a 80 %.92,93,123 Naopak při vynaložení stejného úsilí lze virus HIV izolovat od některých séronegativních pacientů bez AIDS, a dokonce i od normálních, séronegativních jedinců bez rizika infekce virem HIV.124,125 S novější metodou používanou k „izolaci viru HIV“, detekcí p24 v kulturách s plnou nefrakcionovanou krví,126,127 byly zaznamenány pozitivní výsledky u 49/60 (82 %) „pravděpodobně neinfikovaných, ale sérologicky neurčitých“ jedinců a u 5/5 „séronegativních dárců krve“.128
Již v roce 1988 si vědci z Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) v USA uvědomili, že neexistuje korelace mezi „izolací viru HIV“ a pozitivním testem na protilátky (který nazývají dokumentovanou infekcí), a co je důležitější, mezi „izolací viru HIV“ in vitro a jeho přítomností in vivo – „korelace mezi těmito dvěma metodami je omezená; jsou nekonzistentní v tom, že virus nelze detekovat u každé osoby s dokumentovanou infekcí. Kromě toho kultivační technika určuje schopnost infikovaných buněk produkovat virus in vitro, ale nemusí nutně indikovat stav exprese viru in vivo“.129
Zkoumání genomu
V následujících desetiletích po Rousových prvních experimentech prováděl on i další vědci podobné výzkumy s několika druhy zvířat. Přestože neoplazie mohla být vyvolána injekcí filtrátů z nádorových tkání, (infekční retroviry, exogenní retroviry), neexistovaly žádné epidemiologické důkazy, které by naznačovaly infekční původ rakoviny. V roce 1939 Andrews „spekuloval o možné aktivaci latentních virových infekčních částic v rakovinných tkáních“ a v roce 1948 Darlington vyslovil předpoklad, „že takové viry [endogenní viry] by mohly vznikat z buněčných genetických elementů, které nazval proviry“.80 V 50. a 60. letech 20. století byly za důkaz provirové hypotézy považovány následující experimentální důkazy: Zdravá zvířata, u nichž nebylo možné detekovat žádný kompletní virus, měla virové antigeny podobné antigenům exogenního viru a bylo zjištěno, že genomy DNA nebo částečné genomy infekčních retrovirů jsou integrovány do genomů normálních buněk, které neprodukují viry. „Konečný důkaz přišel s izolací infekčních virů z neinfikovaných buněk.“ Bylo zjištěno, že zdravé buňky neprodukující viry při kultivaci viry spontánně produkují.80 Jejich výskyt a výtěžnost lze milionkrát zvýšit mitogenní stimulací,130 technikami kokultivace131 a kultivací buněk se supernatantem z kultur neprodukujících viry.132 (Pozn.: Pro izolaci viru HIV je mitogenní stimulace absolutní podmínkou a ve většině případů se používají všechny výše uvedené techniky).
Obecně se uznává, že „jedním z nejnápadnějších rysů, který odlišuje retroviry od všech ostatních živočišných virů, je přítomnost genomů v chromozomech normálních, neinfikovaných buněk, které jsou blízce příbuzné nebo totožné s genomy infekčních virů“.80
V závislosti na podmínkách zůstává genom proviru neexprimovaný nebo může být exprimován částečně či celý. To může, ale nemusí vést k sestavení virových částic (endogenní retrovirus).80 Jinými slovy, nález antigenů virového genomu a protilátek proti nim není důkazem přítomnosti infekčních částic. Ačkoli většina výše uvedených zpráv pochází z pokusů na zvířatech, „lidský genom obsahuje sekvence DNA příbuzné genomům endogenních retrovirů, které jsou rozděleny do skupin podle sekvenční homologie. Některé z nich jsou přítomny pouze v několika kopiích, zatímco jiné ve stovkách až tisících kopií“.133 Údaje z pokusů na zvířatech také ukazují, že nové retroviry mohou vznikat jak mísením fenotypů, tak genetickou rekombinací a delecí. Pokud buňka obsahuje dva proviry, může se objevit potomstvo, které má genom jednoho z nich, ale strukturní proteiny jednoho (nebo obou) přítomných virů. A naopak, RNA může být virová, ale alespoň některé proteiny mohou být buněčné. V jiných případech částice nemají genom vůbec nebo jim chybí jeden či více genů (geneticky defektní viry). Ke genetickému mísení může dojít mezi virovými genomy nebo mezi virovými a buněčnými geny80,134 a nové retrovirové genomy mohou vznikat přeskupením buněčné DNA způsobeným mnoha faktory včetně patogenních procesů,135,136 což je názor, podle kterého jsou retroviry důsledkem, nikoliv příčinou onemocnění. Doba a výskyt virového genomu „může být miliony let v buňkách zárodečné linie a dny v somatických buňkách“.136 Navíc vzhledem k tomu, že replikační cyklus retrovirů „zahrnuje tři různé kroky: reverzní transkripci, polymerizaci DNA a syntézu RNA z templátu DNA (transkripci) a chyby, způsobené polymerázou během prvního a třetího kroku, nepodléhají korektuře, výsledkem je výrazná variabilita sekvencí“.137 Proto se již v roce 1973 dospělo k závěru, že výše uvedené jevy „se ukážou jako překážka pro jakoukoli genetickou analýzu RNA nádorových virů“ 138 (RNA nádorové viry = retrovirus). Údaje o genomu HIV výše uvedenou předpověď nezměnily a ukazují, že s využitím genomických studií ve snaze prokázat infekci pacientů s AIDS jedinečným exogenním retrovirem HIV může být mnoho problémů. Některé z těchto problémů lze shrnout následovně:
Žádné dva genomy viru HIV nejsou stejné. Ani u jedné osoby nebyly izolovány dva stejné viry HIV. V jednom případě, kdy byly získány dva po sobě jdoucí izoláty s odstupem 16 měsíců, nebyl žádný provirus z prvního izolátu nalezen v izolátu druhém,139 což vedlo jednoho výzkumníka viru HIV k závěru, že „z údajů vyplývá, že nic takového jako izolát [viru AIDS] neexistuje“.140 Od stejné osoby může být v daném čase izolován více než jeden virus HIV.141,142 Mnoho, ne-li všechny proviry detekované in vivo a in vitro jsou defektní.143 U jednoho a téhož pacienta se genomické údaje u monocytů liší od údajů u T-lymfocytů.144 Genetické údaje získané in vitro nekorelují s údaji získanými in vivo.145 „Kultivovat znamená narušit.“ Typ izolovaného viru je určen typy buněk, které byly použity pro izolaci viru HIV.142,146
Sekvence viru HIV nelze nalézt u všech pacientů s AIDS. Gallo a kol. při shrnutí prvních hybridizačních studií s čerstvou tkání dospěli k závěru: „Dříve se nám podařilo izolovat virus HTLV-III z periferní krve nebo tkáně lymfatických uzlin od většiny pacientů s AIDS nebo ARC“ [přibližně 50 % pacientů, o nichž se Gallo zmiňuje]. „Jak se zde však ukázalo, DNA viru HTLV-III není obvykle detekována standardní hybridizací Southern Blottingu v těchto tkáních, a pokud ano, proužky jsou často slabé… zvětšení lymfatických uzlin, které se běžně vyskytuje u pacientů s ARC a AIDS, nemůže být způsobeno přímo proliferací buněk infikovaných virem HTLV-III… nepřítomnost detekovatelných sekvencí viru HTLV-III ve tkáni Kaposiho sarkomu pacientů s AIDS naznačuje, že tento nádor není přímo vyvolán infekcí každé nádorové buňky virem HTLV-III… pozorování, že sekvence viru HTLV-III se v mononukleárních buňkách periferní krve, kostní dřeně a slezině vyskytují jen zřídka, pokud vůbec, poskytuje první přímý důkaz, že tyto tkáně nejsou silně nebo běžně infikovány virem HTLV-III ani v případě AIDS, ani v případě ARC.“ 147 Tyto studie byly potvrzeny mnoha dalšími výzkumníky.
Pro zlepšení detekce byla zavedena metoda polymerázové řetězové reakce (PCR). Avšak „nápadným rysem dosud získaných výsledků“ touto metodou, stejně jako u standardní hybridizační techniky, „je nedostatek nebo zjevná nepřítomnost virové DNA u části pacientů“,148 a pokud je virová RNA nebo DNA nalezena, je „signál“ velmi slabý. Například se předpokládá, že virus HIV se přenáší především pohlavním stykem, a přesto lze „genom viru HIV“ pomocí PCR zjistit u menšiny vzorků spermatu (1/25).149 Je třeba zdůraznit, že pozitivní PCR nelze považovat za důkaz přítomnosti celého genomu viru HIV. Pomocí PCR „mohou být amplifikovány pouze malé oblasti, v nejlepším případě gen“.143 Vzhledem k tomu, že se nedetekuje celý virový genom, a protože většina dosavadních „izolátů“ viru HIV je defektních, nelze detekci části nebo celého genu, či dokonce několika genů považovat za synonyma celého genomu viru HIV. Navíc PCR není standardizovaná a doposud byla provedena pouze jedna studie, ve které byla zkoumána reprodukovatelnost, senzitivita a specificita PCR. V této studii byl jako zlatý standard použit sérologický stav. Specificita byla stanovena měřením procenta negativních výsledků PCR u séronegativních (ELISA), zdravých jedinců s nízkým rizikem (dárců krve). Bylo zjištěno, že PCR není reprodukovatelná a „falešně pozitivní a falešně negativní výsledky byly pozorovány ve všech laboratořích (shoda se sérologií se pohybovala od 40 % do 100 %). Kromě toho se počet pozitivních výsledků PCR významně nelišil mezi vysoce a nízce rizikovými séronegativními osobami“.150
Pozitivní výsledky hybridizace nemusí být pro virus HIV specifické. Když Gallo a jeho spolupracovníci v roce 1984 prováděli první hybridizační studie, zjistili, že pokud byly výsledky pozitivní, hybridizační proužky byly „sotva patrné“, „se slabým signálem“. „Slabý signál“ byl interpretován jako důkaz, že jedinci infikovaní virem HIV obsahují provirus v malém množství mononukleárních buněk periferní krve a v nízkém počtu kopií. Podle Galla a jeho spolupracovníků by však „teoreticky mohla být tato nízká intenzita signálu vysvětlena také přítomností viru vzdáleně homologického s virem HTLV-III v těchto buňkách“.147
Údaje, které se od té doby objevily, naznačují, že tato teoretická možnost může být skutečností. (1) I když se již nepřipouští, že by se virus HIV přenášel hmyzem, v roce 1986 našli vědci z Pasteurova institutu sekvence DNA viru HIV u much tse-tse, u černých brouků a u mravkolvů v Zairu a Středoafrické republice.151 (2) V roce 1984 Gallova skupina oznámila, že genom viru HIV hybridizuje se „strukturními geny (gag, pol a env) viru HTLV-I i viru HTLV-II“.152 V současnosti dostupné důkazy ukazují, že normální lidská DNA obsahuje retrovirové genomové sekvence příbuzné viru HTLV-I a viru HTLV-II.153,154 (3) V roce 1985 Weiss a jeho kolegové oznámili, že z mitogenně stimulovaných kultur T-lymfocytů dvou pacientů s běžnou variabilní hypogamaglobulinémií izolovali retrovirus, který „byl jasně příbuzný s virem HTLV-III/LAV“; důkazem byl pozitivní WB se séry od pacientů s AIDS a hybridizace se sondami viru HIV.155 (4) DNA extrahovaná ze štítné žlázy pacientů s Gravesovou chorobou hybridizuje s „celou oblastí kódující gag p24“ viru HIV.156 (5) Horowitz a kol. „popsali první zprávu o přítomnosti nukleotidových sekvencí příbuzných viru HIV-1 v DNA lidí, šimpanzů a opic makak rhesus od normálních, neinfikovaných jedinců“. „Prokázali přítomnost komplexní skupiny sekvencí příbuzných viru HIV-1“ u výše uvedených druhů a dospěli k závěru, že: „Další analýza členů této skupiny pomůže určit, zda tyto endogenní sekvence přispěly k evoluci viru HIV-1 prostřednictvím rekombinačních událostí nebo zda tyto prvky buď přímo, nebo prostřednictvím proteinových produktů, ovlivňují patogenezi viru HIV“.157
To, že pozitivní hybridizační signály mohou být způsobeny událostmi vyvolanými oxidačními činiteli (mutageny a mitogeny), kterým jsou rizikové skupiny AIDS a kultury vystaveny, naznačují následující skutečnosti: Pozitivní PCR se po přerušení expozice rizikovým faktorům změní na negativní158,159 a monocyty od HIV+ pacientů, v nichž nelze detekovat žádnou DNA viru HIV, a to ani pomocí PCR, se stanou pozitivními na RNA viru HIV po kokultivaci s normálními ConA-aktivovanými T-lymfocyty.160
V roce 1989 a znovu v roce 1992 dospěli vědci z Pasteurova institutu k závěru, že „úkol definovat infekci virem HIV na molekulární úrovni bude obtížný“.145,161 S tím souhlasíme a na základě zde uvedených argumentů a údajů dále docházíme k závěru, že použití testů na protilátky proti viru HIV jako prediktivních, diagnostických a epidemiologických nástrojů infekce virem HIV je třeba pečlivě přehodnotit.
Poděkování
Za trvalou podporu a pomoc bychom rádi poděkovali zejména těmto kolegům: Udo Schüklenk, Barry Page, Bruce Hedland-Thomas, David Causer, Richard Fox, John Peacock, David Prentice, Ronald Hirsch, Patricia Shalala, Keith Jones, Alun Dufty, June Rider Jones, Coronary Barrow, Dorothy Davis, Julian Smith, Mark Strahan, Vincent Turner, Wallace Turner and Graham Drabble. Tato práce je věnována in memoriam Methodiosu Papadopulosovi a Margaret Joan Turnerové.
Odkazy:
- Ratner, L., Haseltine, W., Patarca. R. P. ct al. 1985 . Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature 313:277-284.
- Hausmann, E. H. S., Gelderblom, H. R., Clapham, P.R. et al. 1987. Detection of HIV envelope specific antibodies by immunoelectron microscopy and correlation with antibody titer and virus neutralizing activity. J. Virol. Meth. 16: 125-137.
- Pinter, A . Honnen. W. J . Tilley, S. A et al. 1989. Oligomeric structure of gp41 , the transmembrane protein of human immunodeficiency virus type I . J. Virol. 63:2674-2679.
- Barré-Sinoussi, F . Chermann, J. C . Rey. F. et al. 1983. Isolation of a T-lymphotrophic retrovirus from a patient at risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Science 220:868-871.
- Schüpbach. J., Popovic, M., Gilden, R. V. ct al. 1984. Serological analysis of a subgroup of human T-lymphotrophic retroviruses (HTLV-111) associated with AIDS. Science 224:503-505.
- Damsky, C.H., Sheffield, J.B., Tuszynski, G. P. et al. 1977. Is there a role for actin in virus budding? J. Cell. Biol. 75:593-605.
- Stanislawsky. L., Mongiat, F., Neto, V. M . et al. 1984. Presence of actin in oncornaviruses. Biochem. Biophys. Res. Com. 118:580-586.
- Papadopulos-Eleopulos, E., Turner, V. F. and Papadimitriou, J. M. 1992. Oxidative stress, HIV and AIDS. Res. Lmmunol. 143: 145-148.
- Hinshaw, D. B., Burger, J. M . Beals, T. F. et al. 1991. Actin polymerization in cellular oxidant injury. Arch. Biochem. Biophys. 228:311-316.
- Bach, M.A., Lewis, D. E ., McClure, J.E. et al. 1986. Monoclonal anti-actin antibody recognizes a surface molecule on normal and transformed human B lymphocytes: Expression varies with phase of cell cycle. Cell. Lmmunol. 98:364-374.
- Stricker, R. B., Abrams, D. I., Corash, L. et al. 1985. Target platelet antigen in homosexual men with immune thrombocytopcnia. NEJM 313: 1375-1380.
- Henderson, L. E., Sowder, R., Copeland, T. D. et al. 1987. Direct identification of class II histocompatibility DR proteins in preparations of human T-cell lymphotropic virus type III. J. Virol. 61:629-632.
- Wong-Staal, F. and Gallo, R. C. 1985. Human T-lymphotropic retroviruses. Nature 317:395-403.
- Genesca, J., Jett, B. W., Epstein, J. S. et al. 1989. What do Western blot indeterminate patterns for Human Immunodeficiency Virus mean in EIA-negative blood donors? Lancet II: 1023-1025.
- Ranki, A., Johansson, E. and Krohn, K. 1988. Interpretation of antibodies reacting solely with human retroviral core proteins. NEJM 318:448-449.
- Delord, B., Ottmann, M., Schrive, M. H. et al. 1991. HIV-1 expression in 25 infected patients: A comparison of RNA PCR, p24 EIA in plasma and in situ hybridization in mononuclear cells, p. 113. In: Vol. I, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Todak, G., Klein, E., Lange, M. et al. 1991. A clinical appraisal of the p24 antigen test, p. 326. In: Vol. I, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Courouce, A., Muller, J. and Richard, B. 1986. False-positive Western blot reactions to human immunodeficiency virus in blood donors. Lancet II:921-922.
- Stricker, R. B., McHugh, T. M., Moody, D. J. et al. 1987. An AIDS-related Cytotoxic autoantibody reacts with a specific antigen on stimulated CD4+ T cells. Nature 327:710-713.
- Chassagne, J., Verelle, P., Fonck, Y. et al. 1986. Detection of the lymphadenopathy-associated virus p18 in cells of patients with lymphoid diseases using a monoclonal antibody. Ann. Inst. Pasteur/Immunol. 137D:403-408.
- Parravicini, C.L., Klatzmann, D., Jaffray, P. et al. 1988. Monoclonal antibodies to the human immunodeficiency virus p18 protein cross-react with normal human tissues. AIDS 2:171-177.
- Matsiota, P., Chamaret, S., Montagnier, L. et al. 1987. Detection of natural autoantibodies in the serum of anti-HIV positive-individuals. Ann. Inst. Pasteur/Immunol. 138:223-233.
- Popovic, M., Sarngadharan, M. G., Read, E. et al. 1984. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224:497-500.
- Wilber, J. C. 1991. New developments in diagnosing infections, p. 1-15. In: AIDS Clinical Review, P. Volbering, M. A. Jacobson (Eds.). Marcel Dekker Inc., New York.
- Lundberg, G. D. 1988. Serological diagnosis of human immunodeficiency virus infection by Western blot testing. JAMA 260:674-679.
- Zolla-Pazner, S., Gorny, M. K. and Honnen, W. J. 1989. Reinterpretation of human immunodeficiency virus Western blot patterns. NEJM 320:1280-1281.
- Burke, D. S. 1989. Laboratory diagnosis of human immunodeficiency virus infection. Clin. Lab. Med. 9:369-392.
- Maskill, W. J. and Gust, I. D. 1992. HIV-1 testing in Australia. Australian Prescriber 15; 11-13.
- DeCock, K. M., Selik, R. M., Soro, B. et al. 1991. AIDS surveillance in Africa: A reappraisal of case definitions. BMJ 303: 1185-1189.
- Voevodin, A. 1992. HIV screening in Russia. Lancet 339:1548.
- Working Group on AIDS Case Definition 1990. Epidemiol. Bull. 4:9-11.
- Edwards, V. M., Mosley, J. W. and the Transfusion Safety Study Group. 1991. Reproducibility in quality control of protein (Western) immunoblot assay for antibodies to human immunodeficiency virus. Am. J. Clin. Pathol. 91:75-78.
- CDC. 1989. Interpretation and use of the Western blot assay for serodiagnosis of human immunodeficiency virus type 1 Infections. MMWR 38 No. S-7:1-7.
- Weiss, S. H., Goedert, J. J., Sarngadharan, M. G. et.al. 1985. Screening test for HTLV-III (AIDS agent) antibodies. JAMA 253:221-225.
- Weiss, R. and Thier, S. O. 1988. HIV testing is the answer – what’s the question? NEJM 319:1010-1012.
- Burke, D. S., Brundage, J. F., Redfield, R. R. et al. 1988. Measurement of the false positive rate in a screening program for human immunodeficiency virus infections. NEJM 319:961-964.
- Scarlatti, G. S., Lombardi, V., Plebani, A. et al. 1991. Polymerase chain reaction, virus isolation and antigen assay in HIV-1-antibody-positive mothers and their children. AIDS 5:1173-1178.
- Griner, P. F., Mayewski, R. J., Mushlin, A. I. et al. 1981. Selection and interpretation of diagnostic tests and procedures. Ann. Int. Med. 94 (Part 2):559-563.
- CDC. 1987. Revision of the CDC surveillance case definition for acquired immunodeficiency syndrome. JAMA 258:1143-1145.
- Conley, C. L. and Savarese, D. 1989. Biologic false-positive serologic tests for syphilis and other serologic abnormalities in autoimmune hemolytic anemia and thromobocytopenic purpura. Medicine 68:67-84.
- Boue, F., Dreyfus, M., Bridley, F et al. 1990. Lupus anticoagulant and HIV infection: A prospective study. AIDS 4:467-471.
- Jaffe, J. H., Moore, J. D., Cone, E. J. et al. 1986. HTLV-III seropositivity in 1971-1972 parenteral drug abusers – a case of false positives or evidence of viral exposure? NEJM 314:1387-1388.
- Biggar, R. J., Gigase, P. L., Melbye, M. et al. 1985. ELISA HTLV retrovirus antibody reactivity associated with malaria and immune complexes in healthy Africans. Lancet II:520-523.
- Ternynck, T. and Avrameas, S. 1986. Murine natural monoclonal autoantibodies: a study of their polyspecificities and their affinities. Immunol. Rev. 94:99-112.
- Pateraki, E., Kaklamani, E., Portocalas, K. R. et al. 1986. Autoantibodies in systemic lupus erythematosus and normal subjects. Clin. Rheumatol. 5:338-345.
- Morton, D. L. and Malmgren, R. A. 1968. Human osteosarcomas: immunologic evidence suggesting an associated agent. Science 162:1279-1281.
- Hirshaut, Y., Pei, D. T., Marcove, R. C. et al. 1974. Seroepidemiology of human sarcoma antigen (S1). NEJM 291: 1103-1107.
- Kurth, R., Teich, N. M., Weiss, R. et al. 1977. Natural human antibodies reactive with primate type-C viral antigens. Proc. Natl. Acad. Sci. 74:1237-1241.
- Snyder, H. W. and Fleissner, E. 1980. Specificity of human antibodies to oncovirus glycoproteins: Recognition of antigen by natural antibodies directed against carbohydrate structures. Proc. Natl. Acad. Sci. 77:1622-1626.
- Barbacid, M., Bolognesi, D. and Aaronson, S. A. 1980. Humans have antibodies capable of recognizing oncoviral glycoproteins: Demonstration that these antibodies are formed in response to cellular modification of glycoproteins rather than as consequence of exposure to virus. Proc. Natl. Acad. Sci. 77:1617-1621.
- Essex, M., McLane, M. F, Lee, T. H. et al. 1983. Antibodies to cell membrane antigens associated with human T-cell leukemia virus in patients with AIDS. Science 220:859-862.
- Novick, D. M., Des Jarlais, D, C., Kreek, M. J. et al. 1988. Specificity of antibody tests for human immunodeficiency virus in alcohol and parenteral drug abusers with chronic liver disease. Alcoholism Clin. Exp. Res. 12:687-690.
- European Collaborative Study. 1991. Children born to women with HIV-1 infection: natural history and risk of transmission. Lancet 337:253-260.
- Beneviste, R. E., Ochs, H. D., Fischer, S. H. et al. 1986. Screening for antibodies to LAV/HTLV-III in recipients of immunoglobulin preparations. Lancet I:1090-1092.
- Burinsky, K. I., Chaplinskas, S. A., Syrtsev, V. A. et al. 1988. Reactivity to gag- and env-related sequences in immunoblot assay is not necessarily indicative of HIV infection. AIDS 2:405-406.
- Calabrese, L. H. 1988. Autoimmune manifestations of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Clin. Lab. Med. 8:269-279.
- Bonara, P., Maggioni, L. and Colombo, G. 1991. Anti-lymphocyte antibodies and progression of disease in HIV infected patients, p. 149. In: Vol. II, VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Tumietto, F., Costigliola, P., Ricchi, E. et al. 1991. Anti-lymphocyte autoantibodies: evaluation and correlation with different stages of HIV infection, p. 49. In: Vol. II, VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Morozov, V. A., Ilyinskii, P. O., Uckert, W. A. et al. 1989. Antibodies to structural and nonstructural gag-coded proteins of type-D retroviruses in in humans with lymphadenopathy and AIDS. Int J Tissue React. 1989;11(1):1-5. PMID: 2681033.
- Lucey, D. R., Hendrix. C. W., Andrzejewski. C. et al. 1992. Comparison by race of total serum IgG, IgA and IgM with CD4+ T-cell counts in North American persons infected with the human immunodeficiency virus type 1. J. Acquir. Immun. Defic. Syndr. 5:325-332.
- Papadopulos-Eleopulos, E. 1988. Reappraisal of AIDS: Is the oxidation induced by the risk factors the primary cause? Med. Hypotheses 25: 151-162.
- Papadopulos-Eleopulos, E., Turner, V. F. and Papadimitriou, J. 1992. Kaposi´s sarcoma and HIV. Med. Hypotheses 39:22-29.
- Igel. H. J., Turner, H. C., Kotin, P. et al. 1969. Mouse leukaemia virus activation by chemical carcinogens. Science 166:624-1626.
- Sterk, C. 1988. Cocaine and HIV seropositivity. Lancet 1:1052-1053.
- Kion, T. A. and Hoffmann, G. W. 1991. Anti-HIV and anti-anti-MHC antibodies in alloimmune and autoimmune mice. Science 253:1138-1140.
- Conley, L. J. and Holmerg, S. D. 1992. Transmission of AIDS from blood screened negative for antibody to the human immunodeficiency virus. NEJM 326:1499.
- Burgher, H., Weiser, B., Robinson, W. S. et al. 1985. Transient antibody (to lymphadenopathy-associated/human T-lymphotrophic virus type III and T-lymphocyte abnormalities in the wife of a man who developed the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Int. Med. 103:545-547.
- Esteva, M. H., Blastni, A. M., Ogly, D. and Rodriguez, M. A. 1992. False positive results from antibody to HIV in two men with systemic lupus erythrematosus. Ann. Rhem. Dis. 51:1071-1073.
- Dummer, J. S., Erb, S., Breinig. M. K. et al. 1989. Infection with human immunodeficiency virus in the Pittsburgh transplant population. Transplantation 47:134-139.
- Pitchenik, A. E., Burr. J., Suarez, M. et al. 1987. Human T-cell lymphotrophic virus-III (HTLV-III) seropositivity and related disease among 71 consecutive patients in whom tuberculosis was diagnosed. Am. Rev. Respir. Dis. 135:875-879.
- Nzilambi, N., Mann, J. M., Francis. H. et al. 1986. Seroprevalence among tuberculosis patients in Zaire. In: Abstracts II International AIDS Conference. Paris, No. 105:S17b.
- St. Louis, M. E., Rauch, K. J., Peterson, L. R. et al. 1990. Seroprevalence rates of human immunodeficiency virus infection at sentinel hospitals in the United States. NEJM 323:213-218.
- Chamberland, M., Conley, L. and Dondero, T. 1988. Epidemiology of heterosexually acquired AIDS – United States, p. 264. In: Abstracts IV International AIDS Conference, Stockholm.
- New York City AIDS Surveillance Report, January-March 1992.
- Rodriquez, L., Dewhurst, S., Sinangil. F. et al. 1985. Antibodies to HTLV-III/LAV among aboriginal Amazonian Indians in Venezuela. Lancet II:1098-1100
- Volsky, D. J., Wu, Y. T., Stevenson. M. et al. 1986. Antibodies to HTLV-III/LAV in Venezuelan patients with acute malarial syndromes. NEJM 314:647.
- Rous, P. 1911. A Sarcoma of the fowl transmissible by an agent separable from the tumor cells. J. Exp. Med. 13:397-411.
- Toplin. I. 1973. Tumor virus purification using zonal rotors. Spectra No. 4:225-235.
- Temin, H. M. and Baltimore, D. 1972. RNA-directed DNA synthesis and RNA tumor viruses. Adv. Vir. Res. 17:129-186.
- RNA tumor viruses. 1982. R. Weiss, N. Teich, H. Varmus, J. Coffin (Eds.). Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York.
- Bader, J. P. 1975. Reproduction of RNA tumor viruses. p. 253-331. In: Comprehensive Virology Vol. 4. H. Fraenkel-Conrat, R. R. Wagner (Eds.). Plenum Press, New York.
- Sinoussi, F, Mendiola, L., Chermann, J. C. et al. 1973. Purification and partial differentiation of the particles of murine sarcoma virus (M. MSV) according to their sedimentation rates in sucrose density gradients. Spectra No. 4:237-243.
- Amiesen, J.C. and Capron, A. 1991. Cell dysfunction and depletion in AIDS: the programmed cell death hypothesis. Immunol. Today 12:102-105.
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F. R. and Currie, A. R. 1980. Cell death: The Significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 68:252-306.
- Hoxie. J. A., Fitzharris, T. P., Youngbar, P. R. et al. 1987. Nonrandom association of cellular antigens with HTLV-III virions. Hum. Immunol. 18:39-52.
- McKeating, J. A. and Moore, J. P. 1991. HIV infectivity. Nature 349:660.
- Masquelier, B., Combeau, T. and Poveda. J. 1991. In vitro assays show a dissociation of reverse transcriptase activity and core antigen (p24) production in two HIV-1 isolates from a patient receiving long-term treatment with zidovudine (ZDV). J. Acquir. Immun. Defic. Syndr. 4:499- S05.
- Grunow, R., Valentin, A., Fenyo, E. M. et al. 1991. Release of HIV-1 core protein from infected cells independent of infectious virus particles. p. 157. In: Vol. I, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Tedder, R. S., Semple. M. G., Tenant-Flowers. M. et al. 1992. HIV, AIDS, and zidovudine. Lancet 339:805-806.
- Lemaitre, M., Guétard. D., Hénin, Y. et al. 1990. Protective activity of tetracycline analogs against the cytopathic effect of the human immunodeficiency viruses in CEM cells. Res. Virol. 141:5-16.
- Boulerice, F., Bour, S., Geleziunas, R. et al. 1990. High frequency of isolation of defective human immunodeficiency virus type 1 and heterogeneity of viral gene expression in clones of infected U-937 cells. J. Virol. 64:1745-1755.
- Ehrnst, A., Sonnerborg, A., Bergdahl. S. and Strammegard, O. 1988. Efficient isolation of HIV from plasma during different stages of HIV infection. J. Med. Virol. 26:23-32.
- Learmont, J., Tindall, B., Evans. L. et al. 1992. Long-term symptomless HIV-1 infection in recipients of blood products from a single donor. Lancet 340:863-867.
- Popovic, M., Sarngadharan, M. G., Read, F. et al. 1984. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) trom patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224:497-500.
- Gallo, R. C., Sarin, P. S. and Wu. A. M. 1973. On the nature of the nucleic acids and RNA dependent DNA polymerase from RNA tumor viruses and human cells, p. 13-34. In: Possible Episomes in Eukaryotes, L. G. Silvestri (Ed.). North-Holland Publishing Company, Amsterdam.
- Whitkin, S. S., Higgins, P. J. and Bendich, A. 1978. Inhibition of reverse transcriptase and human sperm DNA polymerase by anti-sperm antibodies. Clin. Exp. Immunol. 33:244-251.
- Tomley, F M., Armstrong, S. J., Mahy, B. W. J. and Owen, L. N. 1983. Reverse transcriptase activity and particles of retroviral density in cultured canine lymphosarcoma supernatants. Br. J. Cancer 47:277-284.
- Weissbach, A., Baltimore, D., Bollum. F. et al. 1975. Nomenclature of eukaryotic DNA polymerases. Science 190:401-402.
- Gallo. R. C., Wong-Staal, F., Reitz, M. et al. 1976. Some evidence for infectious type-C virus in humans, p. 385-407. In: Animal Virology. D. Baltimore, A. S. Huang, C. F. Fox (Eds.). Academic Press Inc., New York.
- Panem, S., Prochownik, E. V., Reale, F. R. et al. 1975. Isolation of type-C virions from a normal human fibroblast strain. Science 189:297-299.
- Panem, S., Prochownik, E. V., Knish, W. M. and Kirsten, W. H. 1977. Cell generation and type-C virus expression in the human embryonic cell strain HEL-12. J. Gen. Virol. 35:487-495.
- Panem, S. 1979. C-type virus expression in the placenta. Curr. Top. Pathol. 66:175-189.
- Samgadharan, M. G., Robert-Guroff, M. and Gallo. R. C. 1978. DNA polymerases of normal and neoplastic mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta. 516:419-487.
- Klatzmann, D., Barré-Sinoussi, F., Nugeyre, M. T. et al. 1984. Selective tropism of lymphadenopathy associated virus (LAV) for helper-inducer T lymphocytes. Science 225:59-63.
- Montagnier, L. 1985. Lymphadenopathy-associated virus: From molecular biology to pathogenicity. Ann. Int. Med. 103:689-693.
- Gendelman, H. E., Orenstein, J. M., Martin, M. A. et al. 1988. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J. Exp. Med. 167:1428-1441.
- Gelderblom, H. R., Hausmann, E. H. S. Ozel. M. et al. 1987. Fine structure of human immunodeficiency virus (HIV) and immunolocalization of structural proteins. Virol. 156: 171-176.
- Gelderblom, H., Reupke, H., Winkel. T. et al. 1987. MHC-antigens: Constituents of the envelopes of human and simian immunodeficiency viruses. Z. Naturforsch. 42C: 1328-1334.
- Gelderblom. H. R.. Reupke, H. and Pauli. G. 1985. Loss of envelope antigens of HTLV-III/LAV, a factor in AIDS pathogenesis? Lancet II:1016-1017.
- Neidrig, M., Rabanus, J. P., L’Age Stehr, J. et al. 1988. Monoclonal antibodies directed against human inimunodeficiency virus (HIV) gag proteins with specificity for conserved epitopes in HIV-1, HIV-2 and simian immunodeficiency virus. J. Gen. Virol. 69:2109-2114.
- Gelderblom, H. R., Ozel, M., Hausmann, E. H. S. et al. 1988. Fine structure of human immunodeficiency virus (HIV), immunolocalization of structural proteins and virus-cell relation. Micron Microsc. 19:41-60.
- Meerloo, T., Parmentier, H. K., Osterhaus, A. et al. 1992. Modulation of cell surface molecules during HIV-1 infection of H9 cells. An immunoelectron microscopic study. AIDS 6:1105-116.
- Lecatsas, G. and Taylor, M. B. 1986. Pleomorphism in HTLV-III, the AIDS virus. S. Afr. Med. J. 69:793-794.
- Hockley, D. J., Wood, R. D., Jacobs, J. P. et al. 1988. Electron microscopy of human immunodeficiency virus. J. Gen. Virol. 69:2455-2469.
- Dourmashkin, R. R., O´Toole. C. M., Bucher, D. and Oxford. J. S. 1991. The presence of budding virus-like particles in human lymphoid cells used tor HIV cultivation. p. 122. In: Vol. I, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Brennan, J. K., Lichtman, M. A., Chamberlain, J. K. and Leblond, P. 1976. Isolation of variant lymphoma cells with reduced growth requirements for extracellular calcium and magnesium and enhanced oncogenicity. Blood 47:447-459.
- Garry, R. F., Fermin, C. D., Hart, D. J. et al. 1990. Detection of a human intracisternal A-type retroviral particle antigenically related to HIV. Science 250:1127-1129.
- Armstrong, J. A. and Horne, R. 1984. Follicular dendritic cells and virus-like particles in AIDS-related lymphadenopathy. Lancet II:370-372.
- Tenner-Racz. K., Racz. P., Bofill, M. et al. 1986. HTLV-III/LAV viral antigens in lymph nodes of homosexual men with persistent generalized lymphadenopathy and AIDS. Am. J. Pathol. 123:9-15.
- Le Tourneau, A., Audouin, J., Diebold, J. et al. 1986. LAV-like viral particles in lymph node germinal centers in patients with the persistent lymphadenopathy syndrome and the acquired immunodeficiency syndrome-related complex. Hum. Pathol. 17:1047-1053.
- O´Hara, C. J., Groopmen, J. E. and Federman, M. 1988. The ultrastructural and immunohistochemical demonstration of viral particles in lymph nodes from human immunodeficiency virus-related lymphadenopathy syndromes. Hum. Pathol. 19:545.
- Culliton, B. J. 1992. The mysterious virus called “isn’t.” Nature 358:619.
- Chiodi, F., Albert, J., Olausson, E. et al. 1988. Isolation frequency of human immunodeficiency virus from cerebrospinal fluid and blood of patients with varying severity of HIV infection. AIDS Res. Hum. Retroviruses 4:351-358.
- Salahuddin, S. Z., Groopman,. J. E., Markham, P. D. et al. 1984. HTLV-III symptom-free seronegative persons. Lancet II:1418-1420.
- Boussin, F., Rey, F., Dormont, D. et al. 1988. Isolation of HIV in a seronegative demented patient without symptoms of immune deficiency. Cancer Detect. Prev. 12:257-265.
- Bayliss, G. J., Jesson, W. J., Evans. B. A. et al. 1989. Isolation of HIV-1 from small volumes of heparinized whole blood. AIDS 3:45-49.
- Fiore, J. R., Angarano, G., Fico, C. et al. 1990. Cell cultures from small amounts of heparinized whole blood enhance HIV-1 isolation rate. AIDS 4:1295-1296.
- Schüpbach, J., Jendis, J. B., Bron, C. et al. 1992. False-positive HIV-1 virus cultures using whole blood. AIDS 6:1545-1546.
- Hart, C., Spira, T., Moore, J. et al. 1988. Direct detection of HIV RNA expression in seropositive subjects. Lancet II:596-599.
- Aaronson, S. A., Todaro, G. J. and Scholnick, E. M. 1971. Induction of murine C-type viruses from clonal lines of virus-free BALB/3T3 cells. Science 174:157-159.
- Hirsch, M. S., Phillips, S. M., Solnik, C. et al. 1972. Activation of leukemia viruses by graft-versus-host and mixed lymphocyte reactions in vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. 69:1069-1072.
- Toyoshima, K. and Vogt, P. K. 1969. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virol. 38:414-426.
- Nakamura, N., Sugino, H., Takahara, K. et al. 1991. Endogenous retroviral LTR DNA sequences as markers for individual human chromosomes. Cytogenet. Cell Genet. 57:18-22.
- Varmus, H. and Brown, P. 1989. Retroviruses, p. 53-108. In: Mobile DNA. D. E. Berg, M. M. Howe (Eds.). American Society for Microbiology. Washington, D. C.
- Weiss, R. A., Friis, R. R., Katz, E. et al. 1971. Induction of avian tumor viruses in normal cells by physical and chemical carcinogens. Virol. 46:920-938.
- Temin, H. M. 1974. On the origin of RNA tumor viruses. Harvey Lect. 69:173-197.
- Wain-Hobson, S. and Myers, G. 1990. Too close for comfort. Nature 347:18.
- Genetics of RNA tumour viruses. 1973. p. 656-699. In: The molecular biology of tumour viruses. J. Tooze (Ed.). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
- Saag, M. S., Hahn, B. H., Gibbons, J. et al. 1988. Extensive variation of human immunodeficiency virus type-1 in vivo. Nature 334:440.
- Marx, J. L. 1988. The AIDS virus can take on many guises. Science 241:1039-1040.
- von Briesen, H., Becker, W. B., Henco, K. et al. 1987. Isolation frequency and growth properties of HIV-variants: Multiple simultaneous variants in a patient demonstrated by molecular cloning. J. Med. Virol. 23:51-66.
- Bolton, V., Pedersen, N. C., Higgins, J. et al. 1987. Unique p24 epitope marker to identify multiple human immunodeficiency virus variants in blood from the same individuals. J. Clin. Microbiol. 25:1411-1415.
- Wain-Hobson, S. 1989. HIV genome variability in vivo. AIDS 3:S13-S18.
- Innocenti, P., Ottmann, M., Morand, P. et al. 1992. HIV-1 blood monocytes: Frequency of detection of proviral DNA using PCR in comparison with the total CD4 count. AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:261-268.
- Meyerhans, A., Cheynier, R., Albert, J. et al. 1989. Temporal fluctuations in HIV quasispecies in vivo are not reflected by sequential HIV isolations. Cell 58:901-910.
- Robey, W. G., Nara, P. L., Poore, C. M. et al. 1987. Rapid assessment of relationships among HIV isolates by oligopeptide analyses of external envelope glycoproteins. AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:401-408.
- Shaw, G. M., Hahn, B. H., Suresh, K. A. et al. 1984. Molecular characterization of human T-cell leukemia (lymphotropic) virus type III in the acquired immune deficiency syndrome. Science 226:1165-1171.
- Simmonds, P., Balfe, P., Peutherer, J. F. et al. 1990. Human immunodeficiency virus-infected individuals contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low copy numbers. J. Virol. 64:864-872.
- Van Voorhis, B. J., Martinez, A., Mayer, K. and Anderson, D. J. 1991. Detection of human immunodeficiency virus type 1 in semen from seropositive men using culture and polymerase chain reaction deoxyribonucleic acid amplification techniques. Fertil. Steril. 55:588-594.
- Defer, C., Agut, H., and Garbarg-Chenon, A. 1992. Multicentre quality control of polymerase chain reaction for detection of HIV DNA. AIDS 6:659-663.
- Becker, J. L., Hazan, U., Nugeyre, M. T. et al. 1986. Infection of insect lines by HIV, agent of AIDS, and evidence for HIV proviral DNA in insects from Central Africa. C.R. Acad. Sci. Paris. 300:303-306.
- Arya, S. K., Gallo, R. C., Hahn, B. H. et al. 1984. Homology of genome of AIDS-associated virus with genomes of human T-cell leukemia viruses. Science 225:927-930.
- Mager, D. L. and Freeman, J. D. 1987. Human endogenous retroviruslike genome with type C pol sequences and gag sequences related to human T-cell lymphotropic viruses. J. Virol. 61:4060-4066.
- Banki, K., Maceda, J., Hurley, E. et al. 1992. Human T-cell lymphotropic virus (HTLV)-related endogenous sequence, HRES-1 encodes a 28-kDa protein: a possible autoantigen for HTLV-I gag-reactive autoantibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1939-1943.
- Webster, A. D. B., Dalgleish, A. G., Beattie, R. et al. 1986. Isolation of retroviruses from two patients with „common variable“ hypogammaglobulinaemia. Lancet I:581-582.
- Ciampolillo, A., Marini, V. and Buscema, M. 1989. Retrovirus-like sequences in Graves’ disease: Implications for human autoimmunity. Lancet I:1096-1100.
- Horwitz, M. S., Boyce-Jacino, M. T. and Faras, A. J. 1992. Novel human endogenous sequences related to human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 66:2170-2179.
- Farzadegan, H., Polis, M., Wolinsky, S. M. et al. 1988. Loss of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) antibodies with evidence of viral infection in asymptomatic homosexual men. Ann. Int. Med. 108:785-790.
- Horsburgh, C. R., Ou, C. Y., Holmberg, S. D. et al. 1989. Human immunodeficiency virus type 1 infection in homosexual men who remain seronegative for prolonged periods. NEJM 321:1678-1680.
- Mikovits, J. A., Lohrey, N., Schuloff, R., Ruscetti, F. 1991. Immune activation of latent HIV-1 expression in monocyte/macrophages, p. 151. In: Vol. 1, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, Italy.
- Vartanian, J. P., Meyerhans, A., Henry, M. and Wain-Hobson, S. 1992. High-resolution structure of an HIV-1 quasispecies: Identification of novel coding sequences. AIDS 6:1095-1098.
Pořád se ukazuje, že celá tahle „věda“ je jen šaškárna. Jedna „hypotéza“ se dokazuje pomocí jiných, nedokázaných (a nedokazatelných) hypotéz a celé se to zabalí do „odborných“ výrazů a frází a používá se k tomu složité přístrojové vybavení. Všechno to u laiků vzbuzuje dojem, jaká je to úžasná věda a většina lidí tomu slepě věří. Nechají si podle této „vědy“ diagnostikovat nemoci, nechávají se podle této „vědy“ léčit a cpou do sebe stejně pochybné výrobky farmaceutického průmyslu. A nedávno se skoro celý svět nechal stejnou vědou zpanikařit a dobrovolně zavřít do totality, která tady ještě nebyla. Pokud ti „vědci“, kteří se touto „vědou“ živí, opravdu těm totálním nesmyslům věří, pak lze vážně pochybovat o jejich schopnosti používat normálním způsobem mozek. A pokud tomu nevěří, tak jsou to bezcharakterní podvodníci a škůdci lidstva.
Jedine, co ten clanek dokazuje je, ze skutecno, ze je autor grafoman, neni nejlepsi kvaifikaci pro sepsani stredne odborneho textu. Na zaklade podobnych „neproverenych hypotez“ funguje cely nas moderni svet, pocitace, GPS nagace, telefony, moderni medicina a vsechny dalsi hi-tech obory. Pro lidi, kteri jsou mimo obor to zdanlive vypada jako samanstvi. Ale jsou za tim miliony hodin experimentu a ziskavani poznatku o svete kolem nas.
Pokud sledujete zde uvedené články, tak zrovna v případě této „vědy“ se velmi často staví na jediném pochybném experimentu či neprokázané hypotéze. A všichni ostatní „vědci“ jen přežvykují stokrát přežvýkanou slámu.
All so-called sub-microscopic particles of whatever nature they may be (inorganic and organic), are imaginary fabrications never really proven to exist.
As for the microscopic particles of an organic nature observed under the optical microscope, the claims of the so-called scientists about their alleged functions have never been proven true by providing uninterpretable, indisputable arguments.
What direct and uninterpretable evidence (evidence that is not subjective, which is why it is not necessary to make assumptions based on it), proves that there is an infinity of sub-microscopic particles and processes in theoretical chemistry, in molecular biology and in all other fields who claim to investigate what exists and occurs at the sub-microscopic level?