Pozn. překl.: Autoři článku zpochybňují existenci viru HIV a poukazují na problémy hypotézy HIV/AIDS z pohledu vědců, kteří existenci ostatních virů vysloveně nezpochybňují (alespoň ji veřejně nezpochybňovali v době psaní článku). Při kritickém přezkoumání vědeckých důkazů pro existenci ostatních virů se však objevují podobné problémy jako v případě chybějících důkazů pro existenci viru HIV (viz předmluva k článku „Kde jsou vědecké důkazy existence viru HIV?“).

Článek byl publikován v časopise Emergency Medicine v roce 1993.

Autoři: Eleni Papadopulos-Eleopulos – biofyzička, Oddělení lékařské fyziky, Royal Perth Hospital; Valendar F Turner – lékař, Oddělení urgentní medicíny, Royal Perth Hospital; John M Papadimitriou – profesor patologie, Oddělení patologie, University of Western Australia

ABSTRAKT

Důkazy, které Robert Gallo a jeho kolegové předložili 4. května 1984 ohledně izolace viru HTLV-III (HIV) a úlohy viru HIV v patogenezi AIDS, jsou kriticky analyzovány. Závěrem je, že nepředstavují důkaz o izolaci retroviru, o tom, že virus je exogenní ani že má příčinnou souvislost s AIDS.

Úvod

V roce 1982 předložil Roben Gallo z Národního onkologického ústavu v USA hypotézu, že příčinou AIDS je retrovirus. O rok později Essex a jeho kolegové¹ zjistili, že pacienti s AIDS mají protilátky proti viru lidské leukémie T-lymfocytů typu 1 (HTLV-I), viru, který Gallo objevil o několik let dříve. Ve stejné době Gallo a jeho kolegové² oznámili izolaci viru HTLV-I od pacientů s AIDS a zastávali názor, že tento retrovirus hraje roli v patogenezi AIDS.

Tato hypotéza však měla několik problémů:

1. Zatímco virus HTLV-I indukuje proliferaci T4-lymfocytů a způsobuje leukémii dospělých T-lymfocytů,³ „charakteristickým znakem“ AIDS byl úbytek T4-lymfocytů a výskyt leukémie u pacientů s AIDS nebyl vyšší než v běžné populaci;
2. Nejvyšší výskyt protilátek proti tomuto viru byl zjištěn v Japonsku, přesto z této země nebyly hlášeny žádné případyAIDS;⁴
3. Ve stejném měsíci, kdy Gallo a kol. a Essex a kol. oznámili své výsledky, popsal Luc Montagnier a jeho kolegové z Pasteurova ústavu izolaci retroviru, později známého jako virus asociovaný s lymfadenopatií (LAV), z lymfatických uzlin homosexuálního pacienta s lymfadenopatií.⁵ Přestože byl tento virus podobný viru HTLV-I, jeden z jeho proteinů, protein s molekulovou hmotností 24 000 (p24), nereagoval s monoklonálními protilátkami proti proteinu p24 viru HTLV-I. Vzorky tohoto viru byly při několika příležitostech zaslány do Gallovy laboratoře.

V květnu 1984 Gallo, Popovič a jejich kolegové publikovali v časopise Science čtyři studie, v nichž tvrdili, že od pacientů s AIDS izolovali další retrovirus podobný viru HTLV-I, který nazvali virus HTLV-III.^6-9 Dne 23. dubna 1984, ještě před zveřejněním studií v časopise Science, svolali Gallo a Margaret Hecklerová, tehdejší ministryně zdravotnictví a sociálních věcí, tiskovou konferenci, na níž oznámili, že Gallo a jeho spolupracovníci našli příčinu AIDS a vyvinuli citlivý test, který ukáže, zda je v krvi přítomen „virus AIDS“.

V roce 1985 Pasteurův institut tvrdil, že Gallo si při vývoji krevního testu virus LAV přisvojil. Následný konflikt, který se dostal až před americké soudy, byl nakonec urovnán dohodou, kterou v roce 1987 podepsali Gallo, Montagnier, americký prezident Reagan a francouzský premiér Chirac. Gallo a Montagnier byli podle této dohody prohlášeni za spoluobjevitele viru AIDS, v současnosti známého jako virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV). Tento konflikt nicméně přitáhl pozornost investigativního novináře Johna Crewdsona a amerického senátora Johna Dingella. V listopadu 1989 zveřejnil Crewdson v novinách Chicago Tribune obsáhlý článek „S obviněním, že Robert C. Gallo ukradl francouzským vědcům virus, o kterém zjistil, že je příčinou AIDS.“¹⁰

To vedlo k internímu „vyšetřování“ obvinění ze strany Národního institutu zdraví (NIH) s tím, že „na činnost interní komise dohlížela externí komise složená z odborníků, ale nezainteresovaných osob (vedená biochemikem Fredericem Richardsem z Yale University).“ ¹¹

Po tomto šetření, které bylo zaměřené na zjišťování faktů, Richardsova komise trvala na „formálním vyšetřování“, a to „na základě podezřelých údajů v jedné ze čtyř zásadních studií, které Gallova laboratoř publikovala v časopise Science 4. května 1984.“¹² V této studii, která byla první ze série čtyř studií, jejímž hlavním autorem byl Mikuláš Popovič, „se objevily rozdíly mezi tím, co bylo ve studii popsáno, a tím, co bylo provedeno.“ ¹⁰ Návrh zprávy o formálním vyšetřování, který sepsal Úřad pro vědeckou integritu Národního institutu zdraví (OSI), byl zveřejněn v září 1991. Návrh zprávy uváděl, že Popovič byl obviněn „z pochybení kvůli nepravdivým tvrzením a nepřesnostem“, které se ve studii objevily, a že Gallo jako vedoucí laboratoře „vytvořil a podporoval podmínky, které vedly ke vzniku zfalšovaných/vymyšlených údajů a zfalšovaných zpráv.“ Gallovo jednání však nebylo považováno za jednání „naplňující formální definici pochybení“.¹³

Konečný návrh zprávy OSI, dokončený v lednu 1992, byl okamžitě kritizován Richardsovým týmem i senátorem Dingellem. To vedlo k přezkoumání zprávy OSI Úřadem pro integritu výzkumu (ORI), který shledal Galla vinným z vědeckého pochybení. Nicméně toto vědecké pochybení prý „nepopírá hlavní zjištění studie v časopise Science z roku 1984.“ ^13,14 Jinými slovy, navzdory výše uvedeným závěrům je v současné době stále přijímáno tvrzení Galla a jeho kolegů: „Výsledky prezentované v našich čtyřech studiích poskytly jasný důkaz, že původcem AIDS a ARC je nový lymfotropní retrovirus HTLV-III“ ¹⁵ (ARC = AIDS related complex). Přestože výsledky Gallova šetření mají značný význam, v následujícím textu budeme mít až na několik výjimek za to, že „mezi tím, co bylo ve studii popsáno, a tím, co bylo provedeno, nebyly žádné rozdíly.“ Údaje však budou kriticky analyzovány s ohledem na následující skutečnosti:

1. Zda popsaná experimentální metoda představuje nezvratný důkaz izolace viru;
2. Zda autoři předložili důkazy prokazující kauzální roli viru HIV při vzniku AIDS.

Pro usnadnění této analýzy může být užitečné uvést, co je obecně považováno za izolaci retroviru.

Izolace retroviru

Peyton Rous¹⁶ se zasloužil o objev a izolaci prvního retroviru. V roce 1911 se mu podařilo opakovaně vyvolat nádory u určitého plemene kuřat pomocí filtrátů bez buněk získaných z nádorů. Je poučné zopakovat Rousovy vlastní úvahy o jeho pozorování: „Za původce tohoto sarkomu drůbeže bude na prvním místě pravděpodobně považován nepatrný parazitický organismus. Analogie s několika infekčními chorobami člověka a nižších živočichů, způsobenými ultramikroskopickými organismy, tento názor podporuje a v současné době se pracuje na jeho experimentálním ověření. Není však vyloučen ani původce jiného druhu. Je možné, že chemický stimulant vytvořený neoplastickými buňkami by mohl způsobit nádor u jiného hostitele a následně vyvolat další produkci stejného stimulantu.“ Filtráty vyvolávající nádory se začaly označovat jako „filtrovatelné viry“ nebo onkoviry a nověji jako exogenní retroviry nebo infekční retroviry.¹⁷ V 50. letech 20. století byly ve zvířecích kulturách a v čerstvé tkáni, zejména nádorové, pomocí elektronové mikroskopie snadno detekovatelné částice, později přisuzované retrovirům. V roce 1970 byl u onkovirů objeven enzym reverzní transkriptáza (RT), který přepisuje RNA na DNA.¹⁸ Z tohoto důvodu se v 70. letech 20. století začalo onkovirům říkat retroviry. V předchozím desetiletí byla zavedena centrifugace v hustotním gradientu k oddělení a izolaci subcelulárních částic včetně virů. Protože bylo zjištěno, že některé buněčné složky mají stejnou vztlakovou hustotu jako viry, když byly viry izolovány z buněčných kultur, nejlepších výsledků bylo možné získat se supernatanty, které měly vysokou koncentraci virů a nízkou buněčnou kontaminaci. K tomu se nejlépe hodily necytopatické viry a kultivační podmínky, které udržovaly maximální životaschopnost buněk. Všechny retroviry izolované před HIV splňují výše uvedené podmínky.¹⁹ S využitím výše uvedených vlastností retrovirů bylo možné opakovaným suspendováním a sedimentací v hustotních gradientech sacharózy získat v pásmu o hustotě 1,16 g/ml relativně čistou koncentraci částic retrovirů – to znamená získat retrovirové částice oddělené od všeho ostatního, a tak je izolovat.¹⁹ Nicméně, jak upozorňují mnozí významní retrovirologové, nebylo možné se vyhnout kontaminaci virového preparátu částicemi, které obsahují reverzní transkriptázu, ale nemusí být ničím jiným než „buněčnými fragmenty“, mikrosomy z narušených buněk, „membránovými vezikuly, které mohou obsahovat další buněčné složky včetně nukleových kyselin“, zejména pokud byl vyvolán „neúmyslný rozpad buněk“.^17-20 Z tohoto důvodu, aby se prokázalo, že materiál, který v hustotním gradientu vytvářel pásmo o hustotě 1,16 g/ml, neobsahoval nic jiného než částice „bez zjevných rozdílů ve fyzickém vzhledu“ a že částice byly skutečně retroviry, byl každý preparát s retroviry dále analyzován pomocí následujících testů:

• a) fyzikální – elektronová mikroskopie na určení množství virů, morfologie a čistoty;
• b) biochemické – aktivita reverzní transkriptázy, virová a buněčná RNA, celkový protein, gelová elektroforéza virových a hostitelských proteinů a nukleových kyselin;
• c) biologické – infekčnost in vivo a in vitro.^19,21

Jinými slovy, prvním krokem při snaze o izolaci retroviru je prokázání, že:

1. Částice pozorované v kulturách vytvářejí v hustotním gradientu pásmo o hustotě 1,16 g/ml;
2. V pásmu o hustotě 1,16 g/ml jsou přítomny téměř výhradně částice;
3. Mezi částicemi nejsou vidět „žádné zjevné rozdíly ve fyzickém vzhledu“.

Izolace viru HTLV-III (HIV)

V první, zásadní studii o izolaci viru HIV s názvem „Detection, Isolation and Continuous Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and Pre-AIDS“ ⁶ („Detekce, izolace a kontinuální produkce cytopatických retrovirů (HTLV-III) od pacientů s AIDS a pre-AIDS“) Popovič, Gallo a jejich kolegové poprvé popsali leukemickou linii T-lymfocytů, zvanou HT. Tato buněčná linie byla vystavena „koncentrovaným kultivačním tekutinám získaným z krátkodobých kultur T-lymfocytů… získaných od pacientů s AIDS nebo pre-AIDS. Nejprve bylo prokázáno, že koncentrované tekutiny obsahují reverzní transkriptázu asociovanou s částicemi.“ Zjištění: (a) reverzní transkriptázy; (b) buněčné imunofluorescence u séra pacienta s hemofilií s pre-AIDS a „králičím antisérem proti viru HTLV-III“ u buněčné linie HT a osmi klonů z ní odvozených, včetně H4, H9 a HI7, byly považovány za důkaz existence retroviru v těchto kulturách, který byl pojmenován HTLV-III. „Produkce viru i životaschopnost buněk infikovaného klonu H4 (H4/HTLV-III) byly sledovány po dobu několika měsíců. Ačkoli produkce viru (aktivita reverzní transkriptázy) kolísala (obr. 2a), kultivační tekutiny odebírané a testované v přibližně 14denních intervalech trvale vykazovaly aktivitu reverzní transkriptázy částic [aktivita reverzní transkriptázy v materiálu, který v hustotním gradientu vytvářel pásmo o hustotě 1,16 g/ml], která byla sledována po dobu více než 5 měsíců…. Údaje tedy ukazují, že tato trvale rostoucí populace T-lymfocytů může nepřetržitě produkovat virus HTLV-III.“ Elektronmikroskopické vyšetření kultury klonu H4 ukázalo „přítomnost extracelulárních virových částic“. Některá zjištění Gallova výzkumu jsou relevantní pro výše uvedené experimenty:

1. Buněčná linie HT nebyla kultivována s koncentrovanými tekutinami pocházejícími z kultur T-lymfocytů jednotlivých pacientů s AIDS, jak je naznačeno ve studii, ale ze směsných vzorků tekutin, nejprve z jednotlivých kultur tří pacientů a nakonec z jednotlivých kultur deseti pacientů.²² Vyšetřování Gallova postupu zjistilo, že tento postup byl „pochybné vědecké kvality“. Jeden vědec jej označil za „opravdu šílený“.¹¹
2. Podle šetření Úřadu pro vědeckou integritu (OSI) tvrzení v publikovaných studiích, že u vzorků bylo „nejprve“ prokázáno, že vylučují reverzní transkriptázu, „je v rozporu s důkazy v zápisnících, podle kterých byla testována pouze jedna ze tří [počátečních kultur].“ ²² Ve výpovědi, kterou Popovič poskytl při vyšetřování, uvedl, že sloučil tekutiny supernatantů z deseti kultur, protože žádná z nich „jednotlivě neprodukovala vysoké koncentrace reverzní transkriptázy“ (hladiny reverzní transkriptázy nejsou uvedeny).

Nicméně:

1. Je důležité si uvědomit, že reverzní transkriptáza se stanovuje pomocí odhadu začlenění nukleotidů značených izotopy vodíku [³H] do DNA a uvádí se jako počty za minutu (cpm);
2. Je známo, že radioaktivita pozadí, tj. radioaktivita v případě nepřítomnosti infekce, může být až 0,4 X 10⁴ cpm.²³ Výše uvedená zjištění vyvolávají další otázky: Pokud byl první virus HTLV-III izolován z buněčných kultur HT, ke kterým byla přidána směs supernatantů, jak bylo tedy „králičí antisérum proti HTLV-III“ pro imunofluorescenční studie získáno? Jak bylo možné zaručit specificitu králičího antiséra vůči viru předtím, než byl virus izolován? Podobně, jak bylo možné před izolací viru zjistit, že sérum pacienta použité k testování materiálu z kultur skutečně specificky reagovalo se stejným virem?
3. Úřad pro vědeckou integritu (OSI) zjistil, že tvrzení, že „kultura“ nepřetržitě produkovala virus HTLV-III (aktivitu reverzní transkriptázy), bylo nesprávné, protože kultura byla „nejméně dvakrát přeočkována“ větším množstvím supernatantu.^11,22

Ve druhé studii⁷ autoři popisují svůj pokus o izolaci viru HTLV-III z mitogenně stimulovaných kultur T-lymfocytů získaných od 115 pacientů s AIDS, pre-AIDS a klinicky normálních homosexuálních mužů. V tabulce I nazvané „Detekce a izolace viru HTLV-III od pacientů s AIDS a pre-AIDS“ uvádějí: „Za pozitivní byly považovány vzorky vykazující více než jednu z následujících charakteristik: opakovaná detekce aktivity reverzní transkriptázy závislé na Mg²⁺ v tekutinách supernatantu; virus pozorovaný elektronovou mikroskopií [retrovirové částice v kulturách]; intracelulární exprese antigenů souvisejících s virem zjištěná pomocí protilátek od séropozitivních dárců nebo pomocí králičího antiséra proti viru HTLV-III; nebo přenos částic.“ Přenosem částic byla míněna detekce reverzní transkriptázy nebo částic v kulturách „lidských T-lymfocytů z pupečníkové krve, kostní dřeně nebo periferní krve“, kultivovaných s koncentrovanými tekutinami z buněčných kultur z tkání získaných od pacientů s AIDS.

V dalších experimentech:^8,9

1. Lyzáty „infikovaných“ buněčných linií H4/HTLV-III a H17/HTLV-III byly testovány se séry pacientů pomocí techniky Western blot (WB);
2. „Specificita reakce [pro HTLV-III] byla studována porovnáním lyzátů H4/HTLV-III a H17/HTLV-III s lyzáty stejných klonů, H4 a H17, před virovou infekcí. Žádný antigen z neinfikovaných klonů nereagoval se séry, s výjimkou proteinu o molekulové hmotnosti 80 000 v buněčné linii H17, který vázal protilátky ze všech testovaných lidských vzorků.“ Autoři studie došli k závěru: „Tyto výsledky jasně ukazují, že antigeny detekované po virové infekci jsou buď proteiny kódované virem, nebo buněčné antigeny specificky indukované infekcí.“
3. Reakce buněk H4/HTLV-III se séry pacientů byla poté porovnána s reakcí materiálu z kultivačních tekutin H4/HTLV-III, který v hustotním gradientu sacharózy vytvářel pásmo o hustotě 1,16 g/ml. Bylo zjištěno, že dva z proteinů, které vytvářely pásmo o hustotě 1,16 g/ml, a to proteiny p41 a p24, reagovaly s některými séry pacientů. Autoři studie došli k závěru: „p24 a p41 lze proto považovat za virové strukturní proteiny“;
4. K testování protilátek proti viru HTLV-III nakonec použili techniku ELISA. 88% (43/49) pacientů s AIDS a 79% (11/14) pacientů s pre-AIDS, „ale méně než 1% heterosexuálních subjektů“ mělo protilátky „reaktivní proti antigenům viru HTLV-III“.

„Aby porozuměli molekulární povaze antigenů rozpoznávaných testem ELISA“, autoři studie analyzovali séra metodou Western blot. „…antigen, který byl nejčastěji a nejvýznamněji detekován ve všech sérech pacientů s AIDS, měl molekulovou hmotnost 41000 (p41)… Reaktivita na p24 viru byla obecně velmi slabá a byla zřetelná pouze ve dvou případech.“

Z výše uvedených údajů je zřejmé, že izolací viru HTLV-III (HIV) byla myšlena detekce více než jednoho z následujících jevů:

1. Reverzní transkriptázy, a to buď v kultivačních tekutinách, nebo v materiálu z těchto tekutin nebo buněčných lyzátů, které v hustotním gradientu sacharózy vytvářely pásmo o hustotě 1,16 g/ml;
2. Částic s morfologickými charakteristikami retrovirů (retrovirových částic) v kultivačních tekutinách, ale ne v materiálu, který v hustotním gradientu sacharózy vytvářel pásmo o hustotě 1,16 g/ml;
3. Proteinů (p41 a v některých případech p24), které v hustotním gradientu sacharózy vytvářely pásmo o hustotě 1,16 g/ml; (aniž by však bylo prokázáno, že jsou jedinečnými složkami částice) a reagovaly se séry pacientů.

Izolace je však definována jako oddělení objektu (viru HIV) od všeho ostatního, a ne jako detekce některých jevů, které jsou mu přisuzovány (reverzní transkriptáza, Western blot) nebo které jsou mu podobné (retrovirové částice). Takové jevy lze použít pouze k detekci retrovirů, nikoli k izolaci, a to pouze tehdy, pokud se nejprve prokáže, že každý z nich je pro daný virus specifický, a to za použití jediného platného zlatého standardu, samotného viru HIV, tedy „izolace viru HIV“. Je důležité poznamenat, že v dřívější (1983) zprávě Montagnierovy skupiny o izolaci viru HIV (viru LAV) byly uvedeny stejné experimentální postupy a zjištění jako ty, které popsal Gallo. Jedinou výjimkou bylo, že Montagnierova skupina „neinfikovala“ imortalizovanou buněčnou linii. Přesto se Gallova skupina domnívala, že Montagnier a jeho kolegové nepopsali „skutečnou izolaci“.⁶ Ve skutečnosti v roce 1984 existovaly důkazy o tom, že reverzní transkriptáza, reakce antigen-protilátka (Western blot) a retrovirové částice nejsou pro retroviry specifické. Nepřímé důkazy, tj. důkazy, které byly získány bez zlatého standardu, z nedávného výzkumu AIDS, výše uvedené potvrdily.

Reverzní transkriptáza

Přestože Gallo označil enzym reverzní transkriptázu za „pro retroviry jedinečnou“, není tomu tak, což zdůraznili i její objevitelé (oba nositelé Nobelovy ceny).¹⁸ Reverzní transkripci lze nalézt v leukemických T-lymfocytech²⁴ (buněčná linie HT a její klony včetně H9, z níž byl poprvé „izolován virus HTLV-III (HIV)“, je leukemická buněčná linie), normálních spermiích²⁵ a podle Harolda Varmuse, dalšího nositele Nobelovy ceny, nověji i v neinfikovaných buňkách kvasinek, hmyzu a savců.²⁶ Již v roce 1973 sám Gallo jako první ukázal, že reverzní transkriptázu lze nalézt v „PHA stimulovaných (ale nikoli nestimulovaných) normálních lidských krevních lymfocytech“.²⁴ Potvrzení této skutečnosti zaznělo na konferenci o AIDS ve Florencii v roce 1991, kde byly předloženy důkazy, že lék AZT může inhibovat aktivitu normální buněčné reverzní transkriptázy,²⁷ což bylo považováno za mechanismus toxicity léku.

Retrovirové částice

Podle definice jsou retrovirové částice obalené infekční částice o průměru 100-120 nm obsahující proteinovou kapsidu a ribonukleoproteinový komplex. Retrovirové částice se dále dělí podle místa sestavení virové částice, tzn. v cytoplazmě nebo na buněčné membráně, a podle některých dalších morfologických znaků. Do této taxonomie jsou zahrnuty podčeledi onkovirů, které zahrnují částice typu C a typu D, a také podčeleď lentivirů.

Před érou AIDS mnoho retrovirologů ukázalo, že nález částic s morfologickými znaky podobnými retrovirům nepředstavuje dostatečný důkaz, že se jedná o retroviry nebo že jde o infekční částice, a to ani v případě, že v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml.¹⁸ Sám Gallo v roce 1976 poukázal na to, že v lidské leukemické tkáni „byly často pozorovány částice podobné viru, které morfologicky a biochemicky připomínají virus typu C, ale zjevně postrádají schopnost replikace.“ ²⁸ Částice s morfologickými znaky retrovirů byly zaznamenány v mléce, v kulturách embryonálních tkání a „ve většině, ne-li ve všech lidských placentách“.^29-31 Byly však považovány za „zajímavý a důležitý problém, který je ještě potřeba vyřešit“.³² Důkazy z výzkumu AIDS ukazují, že:

1. Neexistuje shoda ohledně přesné taxonomické klasifikace viru HIV. Zpočátku byl virus HIV uváděn jako onkovirová částice typu C,⁵ poté jako částice typu D³³ a následně jako příslušník jiné podčeledi, jako lentivirus;³⁴
2. Kultury T-lymfocytů a monocytů „infikované virem HIV“ obsahují kromě částic s morfologií přisuzovanou viru HIV i mnoho dalších „virových částic“, které se nepodobají žádné z „částic viru HIV“.^35-38 Buňky HT (H9), které nebyly „infikovány virem HIV“, které pocházejí z buněčné linie, z níž Gallův tým izoloval poprvé virus HIV (HTLV-III) a z níž pochází většina publikovaných fotografií „částic viru HIV“ z elektronového mikroskopu, stejně jako další buňky používané k „izolaci viru HIV“, a to buňky CEM, buňky C8166, EBV transformované B-lymfocyty a lymfocyty pupečníkové krve, exprimují částice podobné virům, i když se poněkud liší od řady částic považovaných za virus HIV.³⁹ Výše uvedené údaje vyvolávají otázky nejen ohledně původu a úlohy „částic, které nejsou virem HIV“, ale také ohledně „částic viru HIV (HTLV-III)“. Navíc ani Gallův tým, ani nikdo jiný předtím ani potom nezveřejnil elektronové mikrofotografie materiálu získaného z kultur/kokultur od pacientů s AIDS, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml. Není tedy možné zjistit, které částice, pokud vůbec nějaké, mají tuto hustotu;
3. Nejdůležitější je, že se obecně má za to, že částice zjištěné v lymfatických uzlinách pacientů s AIDS jsou částicemi viru HIV. Avšak v jediné elektronmikroskopické studii,⁴⁰ ať už in vivo nebo in vitro, v níž byly použity vhodné kontroly a v níž bylo provedeno rozsáhlé slepé vyšetření kontrol a testovaného materiálu, byly částice přisuzované viru HIV nalezeny u 90% (18/20) pacientů s přetrvávající generalizovanou lymfadenopatií a u 87% (13/15) pacientů s lymfadenopatiemi, které nebyly způsobeny virem HIV, což vedlo autory k závěru: „Přítomnost těchto částic sama o sobě neindikuje infekci virem HIV.“

Reakce antigen-protilátka

Lze tvrdit, že daný protein je antigen pocházející z exogenního retroviru, pokud se nejprve prokáže, že:

1. Protein je strukturální složkou částice;
2. Částice je retrovirus;
3. Protein je kódován výhradně virovým, nikoliv buněčným genem.

Po prokázání výše uvedených skutečností je jediným způsobem, jak prokázat, že protilátky nalezené v séru pacienta s AIDS jsou namířeny proti virovému antigenu, použití antigenu nebo izolovaného viru jako zlatého standardu. Pouhé zjištění, že protein z kultur od pacientů s AIDS vytváří v hustotním gradientu sacharózy pásmo o hustotě 1,16 g/ml a reaguje se séry pacientů s AIDS, nelze považovat za současný důkaz toho, že:

1. Protein je virovým antigenem;
2. Protilátky v séru pacientů s AIDS, které reagují s antigenem, jsou pro tento antigen specifické.

V současné době je známo, že přibližně 80% proteinů, které vytvářejí v hustotním gradientu sacharózy pásmo o hustotě 1,16 g/ml, z nichž některé reagují s některými séry pacientů s AIDS, nepředstavuje žádný z proteinů připisovaných viru HIV.^41-43 A co je nejdůležitější, před zveřejněním studií v časopise Science existovaly důkazy, které se od té doby potvrdily a které jsou v rozporu se závěrem, že „p24 a p41 lze proto považovat za virové strukturní proteiny“:

Protein p41/45

Ve výzkumu AIDS se má za to, že p41 a p45 představují jeden a tentýž protein viru HIV.

1. Stejně jako Gallova skupina, tak i Montagnierův tým o rok dříve zjistil, že séra pacientů s AIDS reagovala s proteinem p41/45 z kultur od pacientů s AIDS a v hustotním gradientu sacharózy vytvářela pásmo o hustotě 1,16 g/ml. Ze svých údajů však usoudili, že proužek p41 „může být způsoben kontaminací viru buněčným aktinem, který byl přítomen v imunoprecipitátech všech buněčných extraktů,⁵ tedy buněk „infikovaných virem HIV“ jakož i buněk neinfikovaných a buněk infikovaných virem HTLV-I. Gallova skupina sice takovou reakci s p41 v neinfikovaných buňkách nenašla, ale našla protein p80 a dospěla k závěru, že reakce byla „nespecifická“.⁸ V současné době je však známo, že p80 stejně jako dva další „proteiny viru HIV“, p120 a p160, jsou oligomery proteinu p41.⁴⁴ Které proteiny (proužky), p41, p80, p120 nebo p160, jsou při Western blot detekovány, závisí na kultuře a podmínkách Western blot, včetně teploty a koncentrace dodecylsulfátu sodného použitého k narušení proteinů, které tvoří v hustotním gradientu pásmo o hustotě 1,16 g/ml;⁴⁵
2. Aktin je všudypřítomný protein nacházející se ve všech buňkách včetně bakterií a některých virů. U dobře známých retrovirů, jako je virus nádoru mléčné žlázy myší, bylo rovněž prokázáno, že obsahují aktin buněčného původu, a předpokládá se, že tento protein hraje klíčovou roli jak při sestavování retrovirů, tak při jejich pučení;^46,47
3. Krevní destičky zdravých jedinců rovněž obsahují protein p41, který reaguje se séry homosexuálních mužů s AIDS a imunitní trombocytopenickou purpurou (ITP) a který „představuje nespecifickou vazbu IgG na aktin v preparátu s krevními destičkami“.⁴⁸
4. Výzkumníci z Pasteurova ústavu prokázali, že séra pacientů s AIDS a rizikových skupin AIDS obsahují vysoké hladiny protilátek proti aktinu příčně pruhované svaloviny.⁴⁹

Protein p24/25

1. Kromě společné publikace s Montagnierem, kde tvrdí, že p24/25 viru HIV je jedinečný, Gallo a jeho kolegové opakovaně uvedli, že p24 viru HTLV-I a p24 viru HIV imunologicky reagují zkříženě;⁵⁰
2. Genesca a kol.⁵¹ provedli Western blot u 100 ELISA negativních vzorků zdravých dárců krve a u 20 z nich byly zjištěny proužky odpovídající proteinům viru HIV, které nesplňovaly tehdejší (1989) kritéria používaná krevními bankami pro pozitivní Western blot. Tyto výsledky Western blot byly považovány za neurčité (WBI), přičemž převládajícím proužkem byl p24 (70% případů). Mezi příjemci krve s WBI bylo 36% osob s WBI šest měsíců po transfuzi, ale stejně tak i 42% osob, které obdržely vzorky, které byly při Western blot negativní. Dárci i příjemci krve zůstali zdraví. Genesca a kol. došli k závěru, že vzorce WBI „jsou mimořádně časté u náhodně vybraných dárců a příjemců a tyto vzorce nekorelují s přítomností viru HIV-1 nebo přenosem viru HIV-1“, „většina takových reakcí představuje falešně pozitivní výsledky“;
3. Protilátky proti p24 byly zjištěny u jednoho ze 150 zdravých jedinců, u 13% náhodně vybraných jinak zdravých pacientů s generalizovaným výskytem bradavic, u 24% pacientů s kožním lymfomem a prodromem T-lymfocytů a u 41% pacientů s roztroušenou sklerózou;⁵²
4. 97% sér homosexuálů s imunitní trombocytopenickou purpurou a 94% sér homosexuálů s lymfadenopatií nebo AIDS obsahuje protilátku, která reaguje s membránovým antigenem 25 Kd nalezeným v krevních destičkách zdravých dárců a pacientů s AIDS, stejně jako s antigenem 25 Kd nalezeným v buňkách ledvin kočkodana zeleného, v lidských kožních fibroblastech a herpes simplex kultivovaném v buňkách opičích ledvin. Tato reakce se nevyskytovala v sérech získaných od pacientů, kteří nebyli homosexuály, s imunitní trombocytopenickou purpurou nebo neimunitní trombocytopenií;⁴⁸
5. Antigen p24 se naopak nevyskytuje u všech HIV pozitivních pacientů, nebo dokonce u pacientů s AIDS. V jedné studii byla polymerázová řetězová reakce (PCR) a p24 použity k detekci viru HIV u pacientů v různých stadiích od asymptomatických až po AIDS. p24 byl detekován u 24% pacientů a RNA viru HIV u 50% pacientů;⁵³
6. V jiné studii „v polovině případů, kdy měl subjekt pozitivní test na p24, měl subjekt později negativní test, aniž by užíval léky, u nichž by se dalo očekávat, že ovlivní hladinu antigenu p24… test je klinicky nevyzpytatelný a měl by být interpretován s velkou opatrností.“ ⁵⁴
   
   

Nález virových částic v kulturách/kokulturách od pacientů s AIDS, nález reverzní transkriptázy a proteinů, které reagují se séry souvisejícími s AIDS, v materiálu ze supernatantu nebo buněčných lyzátů, které v hustotním gradientu sacharózy vytvářejí pásmo o hustotě 1,16 g/ml, tedy nelze považovat za synonymum izolace, nebo dokonce detekce retroviru. I když je retrovirus izolován z kultur/kokultur in vitro z tkání pacientů s AIDS, to samo o sobě nepředstavuje důkaz existence viru in vivo (u pacientů s AIDS), a už vůbec ne důkaz, že byl retrovirus získán exogenně. Je to proto, že:

1. V současné době se obecně uznává, že „jedním z nejvýraznějších znaků, které odlišují retroviry od všech ostatních živočišných virů, je přítomnost genomů [provirů] v chromozomech normálních neinfikovaných buněk, které jsou blízce příbuzné nebo totožné s genomy infekčních virů.“ Je známo, že lidský genom obsahuje kromě jiných provirových sekvencí také sekvence viru HTLV-I^55,56 a viru HIV⁵⁷. V závislosti na podmínkách zůstává provirový genom neexprimovaný, nebo může být exprimován částečně či celý. Exprese genu může, ale nemusí vést k sestavení virových částic (endogenní retrovirus).¹⁷ Zdravé buňky v živočišných kulturách, které neprodukují viry, dříve či později spontánně uvolňují retroviry.²⁰ Výskyt a výtěžnost lze zvýšit (i) mitogenní stimulací;⁵⁸ (ii) kokultivačními technikami;⁵⁹ (iii) kultivací buněk se supernatantem z kultur neprodukujících viry.⁶⁰ Podle jednoho z významných retrovirologů, George Todara, „neúspěch při izolaci endogenních virů z určitých druhů může odrážet omezení technik kokultivace in vitro“;⁶¹
2. Gallův tým, stejně jako všichni ostatní: (i) „izoloval virus HTLV-III (HIV)“ z buněčných kultur; (ii) „izoloval HTLV-III“ z mitogenně stimulovaných, aktivovaných buněčných kultur;
3. Kromě toho Gallo a jeho kolegové použili také techniky kokultivace (klon H4);
4. První „izolace viru HTLV-III“ byla z buněčné linie HT (H4, H9, H17). Při čtení první studie Galla a jeho kolegů by se dalo usuzovat, že buněčná linie HT byla vytvořena v Gallově laboratoři. Vyšetřování Gallova případu však odhalilo, že buněčná linie HT je ve skutečnosti buněčnou linií HUT78, která byla vytvořena v jiné laboratoři od pacienta s leukémií zralých T-lymfocytů, což je onemocnění, o němž Gallo tvrdí, že je způsobeno exogenním retrovirem HTLV-I.³ Je-li tomu tak, pak by všechny buněčné kultury HT a klony z ní odvozené, „infikované virem HTLV-III“ nebo neinfikované, a materiál z těchto kultur, který v hustotním gradientu sacharózy vytváří pásmo o hustotě 1,16 g/ml, měly obsahovat virus HTLV-I, a tedy reverzní transkriptázu a retrovirové částice.

Navíc, protože přibližně 25% pacientů s AIDS má protilátky proti viru HTLV-I¹ a protože imunogenní proteiny viru HTLV-I a viru HIV mají stejnou molekulovou hmotnost, pak by přibližně 25% neinfikovaných kultur HT (H4, H9, H17) mělo, kromě přítomnosti reverzní transkriptázy a částic, při Western blot také vytvářet stejné proužky jako kultury „infikované virem HTLV-III“. Tyto výsledky z Western blot se tedy budou chybně jevit jako pozitivní na virus HTLV-III.

Důkaz, že virus HTLV-III (HIV) má příčinnou souvislost s AIDS

Gallo tvrdí, že ve vědeckých pracích v časopise Science z května 1984 on a jeho kolegové předložili „jednoznačný důkaz, že tento [virus] a pouze tento virus je příčinou AIDS“.⁶² Toto tvrzení přijímá naprostá většina výzkumníků AIDS. Minimálním požadavkem pro takové tvrzení by mělo být předložení následujících důkazů:

1. Že všichni pacienti s AIDS jsou infikováni virem HTLV-III;
2. Infekce virem HTLV-III vede k úbytku T4-lymfocytů, vzhledem k předpokladu, že klinický syndrom je následkem cytotoxicity viru HTLV-III vůči T4-lymfocytům.

Důkazem existence viru HTLV-III byla „izolace viru“ a testy ELISA na protilátky. I kdybychom předpokládali, že předložené údaje představují „skutečnou izolaci“, virus byl izolován u méně než poloviny (10/21) pacientů s AIDS s oportunními infekcemi a u méně než třetiny (13/43) pacientů s Kaposiho sarkomem, což byly tehdy i nyní dvě nejcharakterističtější nemoci AIDS. I kdyby se virus podařilo izolovat od všech pacientů, vzhledem k povaze retrovirů a metodě použité k izolaci viru HTLV-III (kultury, mitogenní stimulace, kokultivace) nelze vyloučit možnost, že virus neexistoval in vivo u pacientů s AIDS. Podmínky kultivace mohly usnadnit expresi endogenního proviru nebo případně syntézu a expresi retroviru de novo. Jedinou metodou použitou k prokázání infekce virem HIV in vivo byly testy na protilátky. Takový test lze použít až poté, co byla jeho specificita prokázána pomocí jediného možného zlatého standardu, viru samotného. To však nebylo provedeno. Navíc test na protilátky, který Gallo použil, byl test ELISA, o němž je v současnosti známo, že je nereprodukovatelný a nespecifický. Ve studii 1,2 milionu zdravých uchazečů o vojenskou službu, kterou provedl plukovník Donald Burke se svými kolegy,⁶³ bylo zjištěno, že ačkoli přibližně 1% všech osob mělo počáteční test ELISA na HIV pozitivní, pouze 50% opakovaných testů ELISA bylo pozitivních. Z těchto 50% byla pouze přibližně jedna třetina spojena se dvěma následnými pozitivními testy Western blot.

V Rusku bylo v roce 1990 z 20 000 pozitivních testů ELISA „potvrzeno pouze 112“ pomocí testu Western blot jako zlatého standardu. V roce 1991 bylo z přibližně 30 000 pozitivních testů ELISA potvrzeno pouze 66 testů.⁶⁴ V žádné ze čtyř Gallových studií nebyla nikde zmíněna cytotoxicita viru HTVL-III. Jediná zmínka o jakýchkoli buněčných abnormalitách nebo patologii obecně je v první studii, kde se uvádí: „Kultury pozitivní na virus konzistentně vykazovaly vysoký podíl kulatých obrovských buněk obsahujících četná jádra (obr. 1a). Tyto buňky se podobají buňkám vyvolaným virem HTLV-I a virem HTLV-II s tím rozdílem, že jádra vykazují charakteristickou tvorbu prstenců.“ (Obr. 1a znázorňuje „pozorování klonu H4/HTLV-III pomocí světelného mikroskopu“).

Klon H4 byl získán z buněčné linie HT „za použití ozářených mononukleárních buněk z periferní krve zdravého dárce krve“. V současné době je známo, že buněčná linie HT, a tedy i H4, jsou buněčnou linií HUT78, získanou v roce 1980 od pacienta s leukémií zralých T4-lymfocytů.^65,66 Je však známo, že jiné buněčné linie, získané od pacientů se stejným klinickým syndromem, vykazují podobnou morfologii, včetně vícejaderných obrovských buněk.⁶⁷ Morfologické vlastnosti buněk pozorované v první studii tedy mohly být přirozenou vlastností buněčné linie HT, nebo důsledkem kultivačních podmínek, nebo obojím, a nikoliv důsledkem viru HTLV-III. Gallo a jeho kolegové neposkytli ani žádné údaje o imunologickém stavu osob, u nichž se pokusili o izolaci viru, a nebyly předloženy ani žádné údaje, které by prokazovaly, že virus HTLV-III je nezbytný a postačující pro úbytek T4-lymfocytů a že úbytek T4-lymfocytů je nezbytný a postačující pro vznik indikátorových onemocnění AIDS.

Závěry

Údaje a argumenty, které Gallo a jeho kolegové předložili, nepředstavují důkaz izolace viru HIV ani jednoznačnou roli viru HIV v patogenezi AIDS. Ačkoli někteří výzkumníci v současné době používají metody „izolace viru“ v podstatě stejné, jaké popsala Gallova skupina, většina z nich používá méně rigorózní metody včetně detekce p24 (technikou protilátek) nebo reverzní transkriptázy. Nehledě na to, že všemi těmito technikami, včetně techniky popsané Gallem a jeho kolegy, která se sama o sobě jeví jako značně problematická, nelze virus HIV „izolovat“ od 20-70% HIV pozitivních pacientů a pacientů s AIDS.^68,69 Stojíme tedy před velmi závažným problémem. Testy na protilátky proti viru HIV, a to jak ELISA, tak Western blot, jediné rutinně používané testy prokazující existenci viru HIV in vivo, dosud nebyly ověřeny oproti jedinému vhodnému zlatému standardu, a to izolaci viru. Dostupné důkazy naznačují, že tento dlouho odkládaný, ale nejzákladnější požadavek na hodnocení testů se pravděpodobně ukáže jako obrovský problém, a zatímco testy na protilátky proti viru HIV jsou užitečnými prognostickými markery u vysoce rizikových skupin, jejich použití jako diagnostické a epidemiologické nástroje infekce virem HIV je sporné.

Dodatky

Dodatek 1. Při testu Western Blot jsou proteiny elektroforeticky rozděleny podle molekulové hmotnosti a náboje. Rozdělené proteiny se poté přenesou na nitrocelulózové proužky procesem známým jako elektroblotování. Po přidání séra a vyvolání proužků se objeví barevné proužky, které představují místa reakcí proteinů/protilátek. Každý proužek je označen malým „p“ označujícím protein a jeho molekulovou hmotností v tisících.

Dodatek 2. U testu ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) se neoddělené proteiny připevňují k pevnému podkladu, jako jsou stěny plastových zkumavek nebo mikrotitračních destiček. Testované sérum se inkubuje v těchto nádobách, v nichž se na antigeny na pevné fázi naváže protilátka. Po promytí se přidá enzymaticky značený anti-humánní imunoglobulin a rovněž se inkubuje. Nádoby se opět promyjí a přidá se substrát specifický pro enzym. Výsledná barevná změna je úměrná množství přítomné protilátky a odečítá se pouhým okem nebo spektrofotometrem.

Poděkování

Rádi bychom poděkovali všem našim kolegům za jejich trvalou podporu a pomoc, a to zejména těmto kolegům: Udo Schüklenk, Barry Page, Bruce Hedland-Thomas, David Causer, Richard Fox, John Peacock, David Prentice, Ronald Hirsch, Patricia Shalala, Keith Jones, Alun Dufty, June Rider-Jones, Coronry Barrow, Dorothy Davis, Julian Smith, Mark Strahan, Vincent Turner, Wallace Turner, Gary James a Graham Drabble.

ODKAZY:

1. Essex M, McLane MF, Lee TH, et al. Antibodies to Cell Membrane Antigens Associated with Human T-Cell Leukemia Virus in Patients with AIDS. Science 1985;220:859-862.
2. Gallo RC, Sarin PS, Gelmann EP, et al. Isolation of Human T-Cell Leukemia Virus in Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Science 1983;220:865-867.
3. Gallo RC. The First Human Retrovirus. Sci Am 1986; 255:78-88.
4. Marx JL. Human T-Cell Leukemia Linked to AIDS. Science 1983;220:806-809.
5. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-Lymphotrophic Retrovirus from a patient at Risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Science 1983;220:868-871.
6. Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, et al. Detection, Isolation,and Continuous Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and Pre-AIDS. Science 1984;224:497-500.
7. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. Frequent Detection and Isolation of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and at Risk for AIDS. Science 1984;224:500-502.
8. Schüpbach J, Popovic M, Gilden RV, et al. Serological analysis of a Subgroup of Human T-Lymphotrophic Retroviruses (HTLV-III) Associated with AIDS. Science 1984;224:503-505.
9. Sarngadharan MG, Popovic M, Bruch L, et al. Antibodies Reactive to Human T-Lymphotrophic (HTLV-III) in the Serum of Patients with AIDS. Science 1984:224:506-508.
10. Culliton BJ. Gallo Inquiry Takes Puzzling New Turn. Science 1990:250:202-203.
11. Culliton BJ. Inside the Gallo Probe. Science 1990;248:1494-1498.
12. Hamilton DP. What Next in the Gallo Case? Science 1991;254:944-945.
13. Palca J. Draft of Gallo Report Sees the Light of Day. Science 1991;253;1347-1348.
14. Cohen J. HHS: Gallo Guilty of Misconduct. Science 1993:259:168-170.
15. Gallo RC, Sarin PS, Kramarsky B. et al. First isolation of HTLV-III. Nature 1986;32I:119.
16. Rous P. A Sarcoma of the Fowl transmissible by an agent separable from the Tumor Cells. J Exp Med 1911;13:397-411.
17. Weiss R, Teich N, Varmus H, Coffin J. RNA Tumor Viruses. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York; 1982.
18. Temin HM, Baltimore D. RNA-Directed DNA Synthesis and RNA Tumor Viruses. Adv Vir Res 1972;17:129-186.
19. Toplin I. Tumor Virus Purification using Zonal Rotors. Spectra 1973;No. 4:225-235.
20. Bader JP. Reproduction of RNA Tumor Viruses. In: Fraenkel-Conrat H, Wagner RR, eds. Comprehensive Virology Vol. 4. New York: Plenum Press, 1975:253-331.
21. Sinoussi F, Mendiola L, Chermann, JC, et al. Purification and partial differentiation of the particles of murine sarcoma virus (M. MSV) according to their sedimentation rates in sucrose density gradients. Spectra 1973;No. 4:237-243.
22. Maddox J. More on Gallo and Popovic. Nature 1992;357:107-109.
23. Lee MH, Sano K, Morales FE, et al. Sensitive Reverse Transcriptase Assay to Detect and Quantitate Human Immimodeficiency Virus. J Clin Microb 1987;25:1717-1721.
24. Gallo RC, Sarin PS, Wu AM. On the nature of the Nucleic Acids and RNA Dependent DNA Polymerase from RNA Tumor Viruses and Human Cells. In: Silvestri LG, ed. Possible Episomes in Eukaryotes. Amsterdam: North-Holland Publishing Company, 1973:13-34.
25. Whitkin SS, Higgins PJ, Bendich A. Inhibition of reverse transcriptase and human sperm DNA polymerase by anti-sperm antibodies. Clin Exp Immunol 1978;33:244-251.
26. Varmus H. Reverse Transcription. Sci Am 1987;257:48-54.
27. Hart DJ, Gogu SR, Agrawal KC, et al. Inhibition of RNA-dependent DNA polymerases (reverse transcriptase) of normal cells by activated azidothymidine:a possible basis for drug toxicities? In: Vol I, Abstracts VII International Conference on AIDS,Florence, 1991:110.
28. Gallo RC, Wong-Staal F, Reitz M, et al. Some Evidence For Infectious Type-C Virus in Humans. In: Baltimore D, Huang AS, Fox CF, eds. Animal Virology. New York: Academic Press Inc., 1976:385-407.
29. Panem S, Prochownik EV, Reale FR, et al. Isolation of Type C Virions from a Normal Human Fibroblast Strain. Science 1975;189:297-299.
30. Panem S, Prochownik EV, Knish WM, Kirsten WH. Cell Generation and Type-C Virus Expression in the Human Embryonic Cell Strain HEL-12. J Gen Virol 1977;35:487-495.
31. Panem S. C Type Virus Expression in the Placenta. Curr Top Pathol 1979;66:175-189.
32. Sarngadharan MG, Robert-Guroff M, Gallo RC. DNA Polymerases of Normal and Neoplastic Mammalian Cells. Biochim Biophys Acta 1978;516:419-487.
33. Klatzmann D, Barr-Sinoussi F, Nugeyre MT, et al. Selective Tropism of Lymphadenopathy Associated Virus (LAV) for Helper-lnducer T Lymphocytes. Science 1984;225:59-63.
34. Montagnier L. Lymphadenopathy-Associated Virus:From Molecular Biology to Pathogenicity. Ann Int Med 1985;103:689-693.
35. Gendelman HE, Orenstein JM, Martin MA, et al. Efficient Isolation and Propagation of Human Immunodeficiency Virus on Recombinant Colony-Stimulating Factor 1-Treated Monocytes. J Exp Med 1988;167:1428-1441.
36. Gelderblom HR, zel M, Hausmann EHS, et al. Fine Structure of Human Immunodeficiency Virus (HIV), Immunolocalization of Structural Proteins and Virus-Cell Relation. Micron Microsc 1988;19:41-60.
37. Lecatsas G, Taylor MB. Pleomorphism in HTLV-III, the AIDS virus. S Afr Med J 1986;69:793-794.
38. Hockley DJ, Wood RD, Jacobs JP, et al. Electron Microscopy of Human Immunodeficiency Virus. J Gen Virol 1988;69:2455-2469.
39. Dourmashkin RR, O´Toole CM, Bucher D, Oxford JS. The presence of budding virus-like particles in human lymphoid cells used for HIV cultivation. In: Vol I, Abstracts VII International Conference on AIDS,Florence, 1991:122.
40. O´Hara CJ, Groopmen JE, Federman M. The Ultrastructural and Immunohistochemical Demonstration of Viral Particles in Lymph Nodes from Human Immunodeficiency Virus-Related Lymphadenopathy Syndromes. Hum Pathol 1988;19:545-549.
41. Henderson LE, Sowder R, Copeland TD, et al. Direct Identification of Class II Histocompatibility DR Proteins in Preparations of Human T-Cell Lymphotropic Virus Type III. J Virol 1987;61:629-632.
42. Lundberg GD. Serological Diagnosis of Human Immunodeficiency Virus Infection by Western Blot Testing. JAMA 1988;260:674-679.
43. Edwards VM, Mosley JW and the Transfusion Safety Study Group. Reproducibility in Quality Control of Protein (Western) Immunoblot Assay for Antibodies to Human Immunodeficiency Virus. Am J Clin Pathol 1991;91:75-78.
44. Pinter A, Honnen WJ, Tilley SA, et al. Oligomeric Structure of gp41, the Transmembrane Protein of Human Immunodeficiency Virus Type I. J Virol 1989;63:2674-2679.
45. Zolla-Pazner S, Gorny MK, Honnen WJ. Reinterpretation of Human Immunodeficiency Virus Western Blot Patterns. NEJM 1989;320:1280-1281.
46. Damsky CH, Sheffield JB, Tuszynski GP, et al. Is there a role for Actin in Virus Budding? J Cell Biol 1977;75:593-605.
47. Stanislawsky L, Mongiat F, Neto VM, et al. Presence of Actin in Oncornaviruses. Biochem Biophys Res Com 1984;118:580-586.
48. Stricker RB, Abrams DI, Corash L, et al. Target Platelet Antigen in Homosexual Men with Immune Thrombocytopenia. NEJM 1985;313:1375-1380.
49. Matsiota P, Chamaret S, Montagnier L. et al. Detection of Natural Autoantibodies in the serum of Anti-HIV Positive-Individuals. Ann Inst Pasteur/Immunol 1987;138:223-233.
50. Wong-Staal F, Gallo RC. Human T-lymphotropic retroviruses. Nature 1985;317:395-403.
51. Genesca J, Jett BW, Epstein JS, et al. What do Western Blot indeterminate patterns for Human Immunodeficiency Virus mean in EIA-negative blood donors? Lancet 1989;II:1023-1025.
52. Ranki A, Johansson E, Krohn K. Interpretation of Antibodies Reacting Solely with Human Retroviral Core Proteins. NEJM 1988;318:448-449.
53. Delord B, Ottmann M, Schrive MH, et al. HIV-1 expression in 25 infected patients: A comparison of RNA PCR, p24 EIA in Plasma and in situ Hybridization in mononuclear cells. In: Vol. I, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, 1991:113.
54. Todak G, Klein E, Lange M, et al. A clinical appraisal of the p24 Antigen test. In:Vol. I, Abstracts VII International Conference on AIDS, Florence, 1991:326.
55. Mager DL, Freeman JD. Human Endogenous Retroviruslike Genome with Type C pol Sequences and gag Sequences Related to Human T-Cell Lymphotropic Viruses. J Virol 1987;61:4060-4066.
56. Banki K, Maceda J Hurley E, et al. Human T-cell lymphotropic virus (HTLV)-related endogenous sequence, HRES-1 encodes a 28-kDa protein: A possible autoantigen for HTLV-I gag-reactive autoantibodies. Proc Natl Acad Sci 1992; 89:1939-1943.
57. Horwitz MS, Boyce-Jacino MT, Faras AJ. Novel Human Endogenous Sequences Related to Human Immunodeficiency Virus Type 1. 1 Virol 1992;66:2170-2179.
58. Aaronson SA, Todaro GJ, Scholnick EM. Induction of murine C-type viruses from clonal lines of virus-free BALB/3T3 cells. Science 1971;174:I57-I59.
59. Hirsch MS, Phillips SM, Solnik C, et al. Activation of Leukemia Viruses by Graft-Versus-Host and Mixed Lymphocyte Reactions In Vitro. Proc Nat Acad Sci 1972;69:1069-1072.
60. Toyoshima K, Vogt PK. Enhancement and Inhibition of Avian Sarcoma Viruses by Polycations and Polyanions. Virol 1969;38:414-426.
61. Todaro GJ, Benveniste RE, Sherr CJ. Interspecies Transfer of RNA Tumour Virus Genes: Implications for the search for „Human“ Type C Viruses. In: Baltimore D, Huang AS, Fox CS, eds. Animal Virology. New York: Academic Press Inc.; 1976:369-384.
62. Connor S. AIDS: Science Stands On Trial. New Scientist 1987; Feb 12:49-54.
63. Burke DS, Brundage JF, Redfield RR, er al. Measurement of the False Positive Rate in a Screening Program for Human Immunodeficiency Virus Infections. NEJM 1988;319:961-964.
64. Voevodin A. HIV screening in Russia. Lancet 1992;339:1548.
65. Gazdar AF, Carney DN, Bunn PA, et al. Mitogen Requirements for the In Vitro Propagation of Cutaneous T-Cell Lymphomas. Blood 1980;55:409-417.
66. Rubinstein E. The Untold Story of HUT78. Science 1990;248:1499-1507.
67. Poiesz B, Ruscetti FW, Mier JW, et al. T-cell lines established from human T-lymphocytic neoplasias by direct response to T-cell growth factor. Proc Natl Acad Sci 1980;77:6815-6819.
68. Chiodi F, Albert J, Olausson E, et al. Isolation Frequency of Human Immunodeficiency Virus from Cerebrospinal Fluid and Blood of Patients with Varying Severity of HIV Infection. AIDS Res Hum Retrovirol 1988;4:351-358.
69. Learmont J, Tindall B, Evans L, et al. Long-term symptomless HIV-1 infection in recipients of blood products from a single donor. Lancet 1992;340:863-867.