Pozn. red.: Účelem tohoto článku je ukázat, že cytopatický efekt (CPE), běžně považovaný za známku přítomnosti „virů“ na buněčných kulturách (a tedy i v klinických vzorcích, které se na buněčné kultury aplikují za účelem tzv. „izolace virů na buněčných kulturách“, která je však ve skutečnosti pravým opakem fyzické „izolace virů“), mohou způsobit i jiné faktory, jako je např. přítomnost některých chemických látek. Vědecká literatura jako příčinu CPE uvádí také některé mikroorganismy, jako např. bakterie, améby a prvoky, a považuje je automaticky za patogeny buněčných kultur.
V článku jsou uvedeny citace z vědeckých studií, které jsou psány z pohledu infekční teorie. Ta však nebyla, stejně jako existence virů, dosud prokázána. Přítomnost výše uvedených mikroorganismů a následný vznik CPE ještě zdaleka nedokazuje kauzalitu. Příčinou CPE v takovém případě mohou být např. další složky obsažené ve vzorku, samotný způsob provedení a podmínky kultivace buněčných kultur, přítomnost odpadních produktů metabolismu kontaminujících mikroorganismů atd. Smyslem tohoto článku tedy není navodit dojem, že některé mikroorganismy CPE přímo vyvolávají. Cílem je poukázat na to, že i z vědecké literatury je evidentní, že CPE není pro „viry“ specifický, a nelze jej proto považovat za důkaz jejich přítomnosti.
Buněčné kultury jsou hlavní metodou pro „izolaci virů“ a jsou považovány za zlatý standard, dokonce i v době, kdy se technologie zdokonalují:
„S nedávným pokrokem v technologii jsou buněčné kultury považovány za zlatý standard pro izolaci virů.“
Typická kultivace virů na buněčných kulturách sestává z odebrání vzorku od nemocné osoby (nazývaného izolát, přestože nic není izolováno), jeho přidání do kultury obsahující buď zvířecí nebo rakovinné buňky, přimíchání toxických přísad, jako jsou antibiotika, fetální bovinní sérum, médium DMEM s „živinami“ atd. Pak se tato směs nechá asi týden odležet a přitom se kontroluje, zda se vytvoří to, čemu se říká cytopatický efekt.
„Změny v buňkách monolayeru (jednovrstvého buněčného povlaku), jako je např. bobtnání, smršťování nebo tvorba syncytia, indikují přítomnost virů. Tyto změny v buněčné kultuře jsou definovány jako cytopatický efekt (CPE), který je způsoben přítomností viru.“
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4850366/#idm140147611910176title
Tento efekt je cílem kultivace. Pokud k němu nedojde, předpokládá se, že ve vzorku není infekční nebo životaschopný „virus“ přítomen.
„Viry jsou ze své podstaty našim očím neviditelné. Jsou to nanostruktury, které se mohou stát viditelnými pouze pomocí elektronové mikroskopie, což je technika, která je časově náročná a není pro každého dostupná. Virolog proto musí najít alternativy, aby mohl pracovat a studovat svůj objekt zájmu. Praktický způsob, jak „vidět“ a nepřímo měřit virovou infekci, je pozorovat poškození, které virus buňce způsobil. Toto poškození je známé jako cytopatický efekt (CPE) a jeho měření se běžně používá ve virologických laboratořích po celém světě.“
https://www.cytosmart.com/resources/virus-induced-cytopathic-effect
Při pohledu na definici cytopatického efektu (CPE) je vidět, že jeho pozorování je určeno pouze pro IDENTIFIKACI „VIRŮ“:
„Cytopatický efekt (CPE) představuje strukturální změny v hostitelské buňce způsobené následkem virové infekce. CPE nastává, když infikující virus způsobí lýzu (rozpuštění) hostitelské buňky nebo když buňka odumře bez lýzy kvůli své neschopnosti reprodukce.“
Pokud je tedy CPE metodou používanou k identifikaci „virů“ v buněčných kulturách a jediným způsobem, jak určit, zda jsou „viry“ „životaschopné“ a „infekční“, co to potom znamená v případě, že existují další možné příčiny CPE v buněčných kulturách, které nejsou způsobeny „viry“?
Podle manuálu o kontaminaci buněčné kultury:
„Jelikož cytopatické viry obvykle ničí kultury, které infikují, mají tendenci být sebeomezující. Když se tedy kultury samy zničí bez zjevného důvodu a nelze najít žádné známky běžných biologických kontaminantů, vina se často svádí na kryptické viry. Jsou to dokonalí pachatelé, neviditelní a neodhalitelní; jsou vinni bez přímých důkazů. To je problém, protože skutečnou příčinou takové destrukce buněčné kultury může být něco jiného, třeba mykoplazmata nebo chemická kontaminace, a v důsledku toho nebude příčina odhalena a stane se ještě větším problémem.“
Understanding and Managing Cell Culture Contamination (fsu.edu)
Vypadá to, že jsou známy další faktory, které mohou způsobit CPE v buněčných kulturách, jako jsou mykoplazmata nebo chemické kontaminanty, a přesto se vina často nesprávně svádí na neviditelné „viry“. Podívejme se, kolik dalších kontaminant způsobujících CPE můžeme najít:
BAKTERIE, AMÉBY, PRVOCI:
Mykoplazmata
„Některá mykoplazmata způsobují závažný cytopatický efekt (CPE) charakterizovaný zakrnělým, abnormálním růstem a zaoblenými, degenerovanými buňkami, zjevně v důsledku podpory nebo inhibice apoptózy.“
„Vazba mykoplazmat na eukaryotické buňky může někdy vést k výraznému cytopatickému efektu. Přichycení umožňuje mykoplazmatům uvolnit škodlivé enzymatické a cytolytické metabolity přímo na buněčnou membránu tkáně. Některá mykoplazmata selektivně kolonizují definované oblasti buněčné kultury. To vede k tvorbě mikrokolonií produkujících mikroléze a malá ložiska nekrózy, jako v případě M. pulmonis, nebo k tvorbě plaků v agarovém systému, jako v případě M. gallisepticum. Mikrokolonizace naznačuje, že receptory specifické pro mykoplazmata jsou lokalizovány v definovaných oblastech buněčného monolayeru. Jiná fermentující mykoplazmata, jako např. M. hyorhinis, se však přichytí na každou buňku a zničí celý monolayer, čímž vznikne generalizovaný cytopatický efekt. U buněk HeLa infikovaných invazivním M. penetrans byla nejvýraznějším efektem vakuolizace hostitelských buněk.“
„Mykoplazmata mohou měnit vývoj virové infekce v buněčných kulturách. Vzhledem k tomu, že mykoplazmata mohou také způsobovat CPE, který se podobá CPE způsobenému viry, mnoho vědců zaměnilo cytolytická mykoplazmata za viry. Mykoplazmata jsou, stejně jako viry, filtrovatelná, způsobují hemadsorbci, hemaglutinaci, jsou odolná vůči některým antibiotikům, jsou schopná vyvolat chromozomální aberace a jsou citlivá na detergenty, éter a chloroform, a proto první zjištěné mykoplazmové patogeny lidí (M. pneumoniae), zvířat (M. mycoides) nebo rostlin (Spiroplasma spp.) byly považovány za viry.“
Izolovaný dentilisin
„Cytopatický efekt izolovaného dentilisinu, včetně vyboulení membrány, vakuolizace, inhibice motility, ztráty kontaktů epiteliálních buněk a uvolňování enzymů v cytosolu, byl prokázán v systémech vícevrstvých epiteliálních buněčných kultur.“
Escherichia coli
„Cytopatický efekt vyvolaný živými bakteriemi E. coli nebo proteinovými extrakty na epiteliálních buňkách tři dny po infekci. U cytotoxického nekrotizujícího faktoru (CNF) a cytoletálního distendujícího toxinu (CDT) je cytopatický efekt pozorovatelný pouze u bakteriálních lyzátů. Naproti tomu u kolibaktinu a faktoru inhibujícího cyklus (CIF) je kontakt mezi bakteriemi a hostitelskými buňkami nutný. Kolibaktin, CDT a CIF vyvolaly cytopatický efekt, jak bylo vidět na zvětšených jádrech a megalocytóze, zatímco CNF indukoval multinukleaci a zvětšení HeLa buněk.“
„Jako kontaminanty buněčných kultur jsou občas identifikovány parazitické i volně žijící améby. Mohou způsobit cytopatický efekt připomínající virové poškození a během 10 dnů mohou kulturu zcela zničit.“
Trofozoity a/nebo cysty A. castellani
„V této studii jsme pozorovali cytopatický efekt, in vitro cytotoxicitu a sekreční profil cytokinů v lidských epiteliálních buňkách rohovky (HCEC) indukované trofozoity a/nebo cystami A. castellani. Test cytotoxicity in vitro odhalil nejvyšší cytotoxicitu vůči HCEC v systému společné kultury s cystami améby.“
Naegleria fowleri
„Naegleria fowleri, kmen HB-1, způsobila destruktivní cytopatický efekt (CPE) v sekundárních embryonálních buňkách myší (ME). Nebyl nalezen žádný důkaz, který by naznačoval, že bezbuněčné cytotoxické faktory vylučované amébami hrají roli v destrukci ME-buněk. V kultivačních systémech určených pro studium cytopatických faktorů se zdálo, že k poškození savčích buněk dochází pouze v důsledku přímého kontaktu s aktivní amébou.“
T. vaginalis
„Pro stanovení možného výsledku interakce T. vaginalis s plicními buňkami byl cytopatický efekt parazitů hodnocen pomocí monolayeru buněk lidského plicního alveolárního bazálního karcinomu (epiteliální buněčná linie A549).
Tato pozorování ukazují, že T. vaginalis způsobuje cytopatický efekt na buňkách A549. K dnešnímu dni je to první zpráva ukazující možnou interakci T. vaginalis s plicními buňkami pomocí kultur A549.“
Cryptosporidium parvum
„V infikovaných monolayerech byl nečekaně zaznamenán přímý cytopatický efekt s rozšířenou programovanou buněčnou smrtí (tj. apoptózou) biliárních epiteliálních buněk, hodnocený morfologicky i biochemicky, začínající během několika hodin po expozici organismu. Nové zjištění specifické cytopatické invaze žlučového epitelu C. parvum může být relevantní pro patogenezi a možnou terapii sekundární sklerotizující cholangitidy pozorované u pacientů s AIDS s biliární kryptosporidiózou.“
„Model buněčné kultury pro biliární kryptosporidiózu popsaný v této zprávě poskytuje užitečnou metodu pro zkoumání cytopatického efektu C. parvum a může poskytnout informace týkající se in vivo důsledků infekce C. parvum.“
https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/pdfdirect/10.1002/hep.510280402
CHEMICKÉ KONTAMINANTY:
Antibiotika a antimykotika:
„Toxicita směsí léků nebyla důkladně studována. Zkoumali jsme proto cytopatický efekt šesti lokálních antimikrobiálních látek na primární kultury buněk lidské rohovky, a to jednotlivě a v kombinaci jakýchkoli dvou látek, abychom určili hodnocení kombinované toxicity a vztah mezi délkou expozice a koncentrací.“
„K odlišení toxicity léků od cytopatického efektu mikrobiální infekce byl vybrán systém in vitro. Buněčné kultury lidských epiteliálních buněk rohovky byly vystaveny působení antimikrobiálních léků po dobu odpovídající klinickému použití. Byly vystaveny stálým a dále postupně klesajícím koncentracím testované látky, napodobujícím snižování dávky.
Cytopatický efekt závisel na léku (lécích), koncentraci a délce expozice. Umístění jednotlivých léků a kombinací v žebříčku nebylo korelováno. Snižování koncentrace léků ne vždy zlepšilo výsledek.“
Jen při zběžném pohledu by se zdálo, že kromě „virů“ existují různé další faktory, které mohou způsobit cytopatický efekt, o kterém se předpokládá, že je způsoben „viry“, jako například:
- bakterie
- améby
- paraziti
- chemické kontaminanty
Evidentně to znamená, že cytopatický efekt pozorovaný v buněčných kulturách NENÍ PRO „VIRY“ SPECIFICKÝ, a nelze ho proto použít jako nepřímý důkaz jejich existence ani jako měřítko jejich životaschopnosti nebo „infekčního“ potenciálu.
