„Většina známých virových onemocnění byla vyloučena a ukázalo se, že původcem infekce je dosud neznámý virus s mnoha zvláštními vlastnostmi: infikuje morčata, ale ne dospělé myši a je větší než známé viry a má jiný tvar.“

(Předmluva ke knize Marburg Virus Disease od G. A. Martiniho a R. Siegerta)

Pokud z nějakého důvodu věnujete pozornost mainstreamovým médiím, pravděpodobně dobře víte o opětovném výskytu mnoha různých „virů“, které se v posledních měsících zdánlivě objevily po celém světě. Byli jsme svědky podivně přesné předpovědi opičích neštovic v květnu 2022, hrozby neznámých „virů“ a onemocnění, jako je nipah/langya, hantavirus, jahodová hepatitida A, rajčatová chřipka a údajný opětovný výskyt dětské obrny. Jedním z dalších méně známých „virů“, který v současné době koluje v médiích, je „virus“ marburg. Pro ty, kteří jej neznají, nemusí znít tak děsivě, ale tento „virus“ má blízkého příbuzného, jehož název může být dostatečným důvodem k tomu, aby lidem neznalým nahnal strach. Pro ty, kteří to nevědí, „virus“ marburg je původní inkarnací „viru“ ebola. Odhaduji, že ten druhý z nich je vám známější.

V posledních týdnech se objevily zprávy o výskytu „viru“ marburg v Ghaně, kde dosud nebyl žádný případ tohoto smrtícího „viru“ zaznamenán. Ghana nejenže počátkem července 2022 ohlásila první případ onemocnění „virem“ marburg, ale bohužel také první úmrtí v souvislosti s tímto onemocněním:

„V Ghaně bylo zjištěno ohnisko horečky marburg, zatímco v západní Africe se, s výjimkou jednoho případu v Guineji v roce 2021, žádné případy nevyskytovaly. V současné době je 98 osob považováno za kontakty a jsou v izolaci. Mezi těmito kontakty nebyl dosud zjištěn žádný případ horečky marburg.

Horečkou marburg dosud onemocněli dva muži, mezi nimiž nebyla žádná souvislost. Oba muži (ve věku 26 a 51 let), kteří vykazovali příznaky, jako je průjem, horečka, nevolnost a zvracení, zemřeli.“

Marburg virus disease: origins and symptoms (unric.org)

Pokud sledujete mainstreamová média, můžete být přesvědčeni o tom, že „virus“ marburg je původcem „vysoce nakažlivé, vysoce virulentní“ a smrtelné nemoci, připravené kdykoli propuknout a stát se další epidemií, které je třeba se obávat:

„Tento život ohrožující virus je vysoce nakažlivý a není na něj znám žádný lék ani schválená vakcína.“

https://www.usatoday.com/story/news/health/2022/07/28/marburg-virus-disease-outbreak-symptoms-treatment/10173445002/

„Světová zdravotnická organizace označuje toto onemocnění za ‚náchylné k epidemiím‘, což znamená, že se může snadno šířit mezi lidmi, pokud se mu nezabrání.“
https://www.healthline.com/health-news/could-the-marburg-virus-start-another-outbreak-what-we-know

„Virové onemocnění marburg je vysoce virulentní onemocnění, které způsobuje hemoragickou horečku s úmrtností až 88 %. Patří do stejné skupiny jako virus, který způsobuje virové onemocnění ebola.“
https://www.who.int/health-topics/marburg-virus-disease#tab=tab_1

„I když onemocnění virem marburg není běžné, virus marburg má potenciál způsobit epidemie s významnou úmrtností.“
https://www.ecdc.europa.eu/en/infectious-disease-topics/z-disease-list/ebola-virus-disease/facts/factsheet-about-marburg-virus

Pohled na epidemie „viru“ marburg však vypovídá o zcela odlišném příběhu. Jedná se teprve o druhé hlášené ohnisko „viru“ marburg v západní Africe, tedy v místě, kde o něm dříve nebylo slyšet. Prvním výskytem „viru“ v této oblasti, který je považován za vysoce nakažlivý „virus“, jenž se údajně šíří kontaktem s tělesnými tekutinami, byl jediný případ hlášený v loňském roce v Guineji. Podobně jako v případě nedávné epidemie opičích neštovic neměli pacienti, u nichž byl v Ghaně diagnostikován „virus“ marburg, k sobě navzájem žádný vztah, neměli v anamnéze žádnou cestu do endemické země ani kontakt se zvířaty, o nichž se tvrdí, že „virus“ přenášejí. Oba muži byli zemědělci, kteří měli nespecifické příznaky, jako je průjem, horečka, nevolnost a zvracení. Bohužel oba po ošetření v nemocnici svým příznakům podlehli. Konečný počet obětí této epidemie „vysoce nakažlivého viru“ se omezil na čtyři osoby.

Jak se „vysoce nakažlivý virus“, který se v západní Africe nikdy předtím nevyskytl, dostal do této části kontinentu, když nakažení v minulosti necestovali do oblasti, kde se „virus“ údajně endemicky vyskytuje? Jak je možné, že se tímto smrtícím „virem“ v roce 2021 v Guineji nakazil pouze jeden člověk a v roce 2022 v Ghaně pouze čtyři lidé, když je vysoce virulentní a nakažlivý? „Virus“ marburg totiž v naprosté většině své historie ukázal, že je všechno, jen ne „vysoce nakažlivý“, přičemž největší ohnisko se objevilo v Angole v roce 2004, kdy se vyskytlo pouze 252 případů. Máme-li vycházet z údajů Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC), pak se od objevení tohoto „vysoce nakažlivého viru“ v roce 1967 vyskytlo na celém světě pouze 475 případů. Zdá se, že tyto statistiky definici „vysoce nakažlivého, vysoce virulentního viru, schopného vyvolat epidemie“ neodpovídají.

Jaký je tedy příběh „viru“ marburg? Kdy a jak se tento nebezpečný patogen objevil na scéně? Jaké nové příznaky onemocnění na počátku podnítily hledání nového etiologického agens? Jaké metody, pokud vůbec nějaké, byly použity k purifikaci, izolaci a charakterizaci částic považovaných za „virus“? Pojďme se podívat, co se nám podaří o prvním objeveném „viru“ z čeledi Filoviridae zjistit.

Podle CDC byl „virus“ marburg objeven v roce 1967 poté, co u laboratorních pracovníků provádějících výzkum, kteří přišli do styku s kočkodany, propukly příznaky běžně spojované s hemoragickou horečkou. „Virus“ marburg je jedním ze sedmi druhů „filovirů“, přičemž dalších šest patří k samostatným verzím „viru“ ebola. Příznaky onemocnění spojené s „virem“ marburg jsou nespecifické a překrývají se s mnoha různými onemocněními, jako je malárie, břišní tyfus nebo horečka dengue a/nebo některé z „virových“ hemoragických horeček, které mohou být v určité oblasti endemické. To samozřejmě ztěžuje (tj. znemožňuje) klinickou diagnózu vzhledem k podobnostem mezi těmito onemocněními. Jinými slovy, na „viru“ marburg není nic nového ani specifického, protože je to jen další z dlouhé řady názvů daných stejným příznakům onemocnění:

„Virová choroba marburg je vzácná, ale závažná hemoragická horečka, která postihuje jak lidi, tak primáty. Je způsobena virem marburg, geneticky unikátním zoonotickým (neboli zvířaty přenášeným) RNA virem ze skupiny filovirů. Jedinými dalšími známými členy skupiny filovirů je šest druhů viru ebola.

Virus marburg byl poprvé rozpoznán v roce 1967, kdy se současně objevila ohniska hemoragické horečky v laboratořích v Marburgu a Frankfurtu v Německu a v Bělehradě v Jugoslávii (nyní Srbsko). Onemocnělo 31 osob, zpočátku laboratorní pracovníci, po nich několik zdravotníků a rodinných příslušníků, kteří o ně pečovali. Bylo hlášeno sedm úmrtí. První nakažení byli při výzkumu vystaveni kočkodanům dovezeným z Ugandy nebo jejich tkáním. Jeden další případ byl diagnostikován zpětně.“

„Klinická diagnóza virové choroby marburg může být obtížná. Mnoho jejích příznaků je podobných jiným infekčním onemocněním (jako je malárie, břišní tyfus nebo horečka dengue) nebo virovým hemoragickým horečkám, které se mohou v dané oblasti endemicky vyskytovat (jako je horečka Lassa nebo ebola). To platí zejména v případě, že se jedná pouze o jediný případ.“

https://www.cdc.gov/vhf/marburg/index.html

O „objevu“ tohoto nového „filoviru“ se můžeme hodně dozvědět ze spisů Wernera Slenczky, muže, který se sám označuje za odborníka na „filoviry“, protože se úzce podílel na jejich objevu. Dr. Slenczka je docentem na Virologickém ústavu, který pomohl identifikovat pomocí elektronové mikroskopie částice podobné vláknům, o nichž se tvrdí, že jsou „virem“. Napsal několik článků, v nichž podrobně popsal, co se během procesu „objevování“ stalo, a uvedl několik poměrně zajímavých odhalení.

První úryvky zde uvedené jsou z jeho článku o „viru“ marburg, který publikoval v roce 2007, tedy 40 let poté, co byl poprvé identifikován. Podle Slenczky se první lidé „nakažení“ „virem“ v srpnu 1967 léčili ve svých domovech po dobu až 10 dní. Příznaky nebyly zpočátku nijak znepokojivé, ale postupně se zhoršovaly, jak byla podávána blíže nespecifikovaná léčba. Zpočátku se předpokládalo, že pacienti trpí břišním tyfem nebo úplavicí. Když se příznaky zhoršily, pacienti byli přijati do nemocnice. Ze 7 pacientů, u nichž se objevilo krvácení, jich 5 nakonec své nemoci podlehlo, někteří již jeden den po přijetí do nemocnice. Případy nového „viru“ i odhady inkubační doby byly nakonec stanoveny zpětně. Zajímavé je, že jeden z pacientů s těžkým onemocněním, který nebyl nikdy hospitalizován, se sám zcela uzdravil. Na rozdíl od tvrzení dnešních mainstreamových médií bylo tehdy nakonec rozhodnuto, že „virus“ nebyl vysoce nakažlivý, protože se vyskytlo pouze několik sekundárních případů, žádné terciární infekce a žádné nové případy po počátečním „propuknutí“ nemoci.

V polovině září 1967 byly zahájeny pokusy s morčaty s cílem zjistit příčinu onemocnění. Výzkumníci sériově pasážovali toxickou břečku mezi morčaty a po pozdějších pasážích vyvolali „podobné“ příznaky jako u lidského onemocnění, čímž dospěli k závěru, že získali filtrovatelný „virus“, přestože se jim nepodařilo získat žádné snímky „viru“ z elektronového mikroskopu. Tkáně sleziny a jater morčat vyšetřil Slenczka pomocí imunofluorescence za použití protilátek a u morčat, ale ne u lidí, byly nalezeny intracytoplazmatické inkluze. Touto metodou byla vybrána krev „nakažených“ zvířat, která byla následně použita k vyšetření elektronovým mikroskopem pomocí nové techniky vyvinuté vedoucím výzkumníkem. Následně „objevili“ „virus“ u zvířat (ale ne u lidí) v listopadu 1967, téměř tři měsíce po prvních případech onemocnění:

Čtyřicet let viru marburg

„Na začátku srpna 1967 byli do univerzitních nemocnic v Marburgu a Frankfurtu přijati pacienti s neobvyklými příznaky svědčícími o infekčním onemocnění. První pacienti byli léčeni doma po dobu až 10 dní, i když onemocnění podle popisu začínalo náhle extrémní malátností, bolestí svalů, bolestí hlavy a rychlým zvýšením teploty až na 39 °C a více. Přestože klinické příznaky nebyly během prvních 3–4 dnů příliš znepokojivé, na konci prvního týdne se objevily další příznaky a projevy. Gastrointestinální příznaky, jako je nevolnost, zvracení a průjem, lékařům naznačovaly, že diagnózou může být úplavice nebo břišní tyfus. Pacienti byli proto přijati do nemocnice. Při přijetí byl u většiny pacientů pozorován zánět spojivek, exantém a enantém, ale shigely nebo salmonely nalezeny nebyly. Během druhého týdne od začátku onemocnění klesla teplota pacientů na 38 °C a u přibližně 25 % pacientů byly zaznamenány petechie a závažnější příznaky hemoragické diatézy. Podle hladin transamináz dosáhla destrukce jater maxima 7. a 8. den po začátku onemocnění. Byla zjištěna leukopenie s výskytem nezralých polymorfonukleárních leukocytů a trombocytopenie (< 10 000 buněk/mm³). Pacienti krváceli ze všech tělních otvorů a z vpichů jehlou. Pokud byl výsledek fatální, došlo k úmrtí během druhého týdne po začátku onemocnění, v průměru 9. den (rozmezí 7.–16. den). V některých případech pacienti zemřeli na těžký hemoragický šok den po přijetí do nemocnice. Neblahým znamením byly těžké krvácivé příznaky, které byly pozorovány přibližně u 25 % pacientů. Všichni pacienti, kteří zemřeli, měli krvácení. Ze 7 pacientů se zjevným krvácením jich 5 onemocnění podlehlo. Orchitida (zánět varlat), typický příznak pozdního stádia, se objevila ve třetím týdnu po začátku onemocnění, nebo dokonce při relapsu během pátého týdne. Mentální zmatenost a parestézie svědčily o postižení mozku. Relapsy s hepatitidou, orchitidou a uveitidou s přetrváváním viru ve spermatu a v přední oční komoře byly typické během rekonvalescentní fáze infekce virem marburg i virem ebola. V jednom případě přenesl pacient infekci na svou manželku 120 dní po začátku onemocnění, pravděpodobně pohlavním stykem. Virus byl detekovatelný v semenné tekutině.

Inkubační dobu onemocnění virem marburg bylo možné odhadnout pouze zpětně, poté, co byl znám zdroj infekce a datum expozice. Inkubační doba se pohybovala od 5 do 9 dnů, průměrně 8 dnů. Poměr primární a sekundární infekce byl v Marburgu 21:3, ve Frankfurtu 4:2 a v Bělehradě 1:1. Tři případy sekundární infekce byly následkem neúmyslného píchnutí jehlou, v jednom případě se technik na patologii při pitvě řízl nožem na předloktí. K přenosu nákazy vzduchem mezi lidmi nedošlo, jak naznačuje např. případ mladého muže, který spal se svým bratrem v jedné posteli jen několik dní před jeho smrtí; u bratra se onemocnění nerozvinulo a o 6 měsíců později byl na virus marburg séronegativní. Jeden z pacientů byl v době propuknutí nákazy těžce nemocný, ale z neznámých důvodů nebyl hospitalizován. Uzdravil se a o 15 let později tvrdil, že byl nakažen virem marburg. V té době podstoupil sérologické vyšetření a bylo zjištěno, že je séropozitivní na protilátky proti viru marburg metodou nepřímé imunofluorescence a metodou ELISA. Přišel do kontaktu s buněčnými kulturami opičích ledvin, které se používaly k výrobě vakcíny proti poliomyelitidě. Po 6 měsících od vypuknutí nákazy byly získány vzorky krve od 120 osob, které byly v úzkém kontaktu s pacienty nebo s infekčním materiálem, ale u nichž se onemocnění nerozvinulo. Vzorky byly testovány na přítomnost protilátek proti viru marburg pomocí komplement fixačního testu, testů nepřímé imunofluorescence a ELISA a bylo zjištěno, že jsou séronegativní. Nebyl tedy zjištěn žádný náznak asymptomatické infekce.“

„V polovině září bylo zřejmé, že původce vykazuje nízkou nakažlivost. Vyskytlo se pouze několik případů sekundární infekce a žádný případ terciární infekce a během předchozích dvou týdnů se nevyskytly žádné nové případy. Rudolf Siegert a jeho čínský kolega Hsin Lu Shu proto obnovili pokusy s morčaty. Zjistili, že původce se může přenášet mezi morčaty a vykazuje patogenitu, která se zvyšuje od pasáže k pasáži. Při třetí pasáži onemocněla zvířata horečkou, hepatitidou a hemoragickým onemocněním, které se velmi podobalo lidskému onemocnění, a uhynula do 10 dnů po inokulaci s výrazným poklesem teploty. Všechny pokusy o určení etiologického agens pomocí světelné nebo elektronové mikroskopie však selhaly. Hlavním problémem byly oportunní bakteriální infekce.

V této době byly k dispozici vzorky lidského a morčecího rekonvalescentního séra a některé vzorky séra byly označeny fluoresceinem pro test přímé imunofluorescence, pomocí kterého zjistil W.S. o tři týdny později intracytoplazmatické inkluze v tkáních infikovaných morčat. Zvířata, která měla infikované buňky v játrech a slezině, byla vybrána pro další studie pomocí elektronové mikroskopie. Vzorky krve těchto zvířat byly inaktivovány formalínem a zaslány Dietrichu Petersovi do Institutu Bernharda Nochta v Hamburku. Plazma ošetřená formalínem byla pomocí nové techniky vyvinuté Gerhardem Müllerem odstředěna přímo na mřížky elektronového mikroskopu a bylo provedeno negativní barvení. Pomocí těchto metod byl virus marburg identifikován 20. listopadu, tedy méně než 3 měsíce po vypuknutí nákazy.“

https://academic.oup.com/jid/article/196/Supplement_2/S131/858753

Je třeba poznamenat, že podle Slenczkova popisu událostí nebyl během vyšetřování možné příčiny onemocnění laboratorních pracovníků v roce 1967 žádný „virus“ nikdy řádně purifikován a izolován. Prvotní důkazy o existenci „viru“ marburg se v podstatě omezily na experimentální vyvolání nemoci u morčat sériovým podáváním nepřirozených injekcí krve/tkání do břišní (peritoneální) dutiny, na vyšetření jejich sleziny a jater pomocí nespecifických protilátek, aby se našly nespecifické inkluze, a na následné pořízení snímků krve nemocných zvířat elektronovou mikroskopií a tvrzení, že náhodné částice pozorované v nepurifikovaných a kontaminovaných vzorcích jsou dotyčným „virem“. Nakonec se po mnoha neúspěšných pokusech a omylech tvrdilo, že „virus“ lze množit na buněčné kultuře (bez cytopatického efektu) s použitím materiálu z morčat (nikoli lidí).

Pro lepší pochopení podvodných metod používaných k propagandě nového smrtelně nebezpečného „viru“ veřejnosti si ještě více rozebereme hlavní tři oblasti zájmu (pokusy na zvířatech, zobrazování pomocí elektronové mikroskopie a buněčné kultury) a podíváme se, co ukazují důkazy.

1. Pokusy na zvířatech

„Experimentální infekce má zjevně za následek 100% úmrtnost. Pokud by k této situaci došlo v přírodě, je zřejmé, že by nemohlo dojít k žádné sérologické pozitivitě. Pokud se však experimentální způsob inokulace liší od způsobu, který se vyskytuje v přírodě, je možné, že ke 100% úmrtnosti nedojde.“

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-01593-3_22

Prvním důkazem pro existenci nového „viru“ bylo vyvolání „podobných“ příznaků u morčat opakovaným injekčním podáváním sériově pasážovaných nemocných tekutin/tkání. Co tyto injekce skutečně obsahovaly, je obtížné určit, protože původní studie je v němčině a překlad není jasný. Studie, kterou vedl Rudolf Siegert, zmiňuje provádění následných pasáží plné krve, plazmy nebo materiálu z orgánů, avšak přesné metody zůstávají kvůli špatnému překladu nejasné.

Naštěstí Rudolf Siegert popsal velkou část výzkumu viru marburg ve své knize z roku 1971. Kupodivu do ní nezahrnul svoji původní studii O etiologii neznámé lidské infekce pocházející z opic, přesto však poskytl studii vysvětlující postupy používané při pasážování „viru“ na morčatech, která poskytla určitý vhled do druhu experimentů, které byly nakonec provedeny. Z níže přiložené studie je patrné, že sražená krev byla hemolyzována sterilní destilovanou vodou a orgány byly rozmělněny pomocí hmoždíře. Ředící roztok fosfátového pufru obsahující 10 p. 100 normálního králičího séra byl přidán do krevní směsi, která byla použita k intracerebrální (do mozku) a intraperitoneální (do břišní (peritoneální) dutiny) injekci myším a k intraperitoneální injekci morčatům. Výzkumníci přiznali, že všechny pokusy o „izolaci“ byly negativní, s výjimkou pokusů u morčat, protože po injekci vzorků krve, suspenzí orgánů a směsných vzorků orgánů kočkodanů do peritoneální dutiny se u zvířat 4 až 6 dní po inokulaci objevila febrilní reakce (horečka). Klinické příznaky u zvířat zahrnovaly ztrátu chuti k jídlu a ztrátu hmotnosti, „nafouklý obličej“ a zvětšení varlat. Výzkumníci dospěli k závěru, že z lidského a opičího materiálu byl „izolován“ organismus, který byl přenesen čtyřmi až šesti pasážemi na morčata, přestože žádný „virus“ nebyl nikdy purifikován, izolován a vizualizován:

Pasážování viru marburg na morčatech

„Sražená krev byla hemolyzována sterilní destilovanou vodou a orgány byly rozmělněny pomocí hmoždíře a ředícího roztoku fosfátového pufru obsahujícího 10 p. 100 normálního králičího séra tak, aby konečná koncentrace činila asi 20 % objemu.“

„Sající myši byly inokulovány intracerebrálně (ic) a intraperitoneálně (ip) 0,02 ml směsi.

Morčata (200–300 g) byla inokulována intraperitoneálně dávkou 4 ml. Pro další pasážování byla intraperitoneálně aplikována plná krev odebraná srdeční punkcí.“

Výsledky
Všechny pokusy o izolaci byly negativní s výjimkou morčat.

Pasážování na morčatech
U morčat, kterým byly intraperitoneálně injekčně aplikovány vzorky krve pacienta H. F. (HF 1 a HF 2), orgánové suspenze pacienta P. S. a směsné vzorky orgánů kočkodanů M 10 a M 14, se 4 až 6 dní po inokulaci konzistentně objevovala febrilní reakce. Febrilní stádium trvalo 3 až 7 dní.

Plná krev odebraná během této febrilní fáze byla úspěšně pasážována intraperitoneálně u morčat po 3 až 6 pasážích. Inkubační doba se zkrátila na 2 až 3 dny a některá morčata uhynula 7 až 17 dní po inokulaci. Klinické příznaky u zvířat byly: ztráta chuti k jídlu a ztráta hmotnosti, ‚nafouklý obličej‘ a zvětšení varlat. Při pitvě jsme zjistili zvětšení sleziny a konsolidaci plic.

Horečnaté reakce u morčat byly vyvolány pomocí časných krevních vzorků z předchozí pasáže. V jednom případě následovala horečnatá reakce po inokulaci krve odebrané 11. den. Tato skutečnost potvrzuje pozorování, že infekce zřejmě vyvolává dlouhotrvající virémii.“

Závěry
„Výše uvedené výsledky ukazují, že z lidského a opičího materiálu byl izolován organismus, který byl u morčat přenesen čtyřmi až šesti pasážemi.“

DOI: 10.1007/978-3-662-01593-3_16

Jak je patrné z výše uvedené studie, vědci zaměňují experimentální vyvolání onemocnění u morčat prostřednictvím sériového pasážování a nepřirozených cest infekce s „izolací“ „viru“. „Virus“ nebyl ani v jednom případě purifikován a izolován z tekutin nemocného člověka, opice ani morčete. Kromě nespecifické horečky, úbytku hmotnosti a ztráty chuti k jídlu (k nimž docházelo po injekcích toxické nepurifikované břečky do peritoneální dutiny) žádný z příznaků, které se u morčat objevily (nafouklý obličej, zvětšená varlata), s onemocněním u lidí vůbec nesouvisel. Ve skutečnosti Rudolf Siegert a Werner Slenczka později ve své práci Laboratorní diagnostika a patogeneze připustili, že pokud jde o patogenezi onemocnění u člověka, „zjevně virulence viru marburg se liší u opice, člověka a morčete.“ Přesto bylo na základě těchto experimentálních výsledků určeno, že v tekutinách nemocných morčat se skrývá nový patogenní „virus“, a tato zvířata byla následně použita ke zkoumání elektronovým mikroskopem ve snaze tento nový „virus“ najít.

2. Snímky z elektronového mikroskopu

„Druhá možnost rychlé diagnózy spočívá v přímém průkazu viru elektronovým mikroskopem. Podle Peterse a Müllera se to může podařit, pokud je původce přímo odstředěn ze séra nebo plazmy na nosiči. Charakteristická morfologie nenechává o diagnóze žádné pochybnosti. Nemáme však žádné zkušenosti, které by nám umožnily odpovědět na otázku týkající se pravděpodobnosti, že při této metodě může být původce přehlédnut. Z tohoto důvodu by měly v každém případě následovat pokusy o izolaci viru u morčat a v různých systémech buněčných kultur.“

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-01593-3_22

Přestože se výzkumníkům poté, co u morčat vyvolali onemocnění, zpočátku nepodařilo identifikovat „virus“ pomocí elektronové mikroskopie, nakonec na základě výsledků přímého a nepřímého značení protilátkami zjistili, že „virus“ se nachází v játrech a slezině těchto zvířat. Studie Rudolfa Siegerta sice neuvádí mnoho informací o tom, jak zjistili, že pozorované částice jsou skutečným „virem“, který hledali, ale uvádí několik zajímavých poznámek o jejich morfologii, které se naštěstí v překladu neztratily:

O etiologii neznámé lidské infekce pocházející z opic

„Popsané výsledky ukazují, že ‚virus marburg‘ není identický, ale je morfologicky blízce příbuzný viru vezikulární stomatitidy, coval, egtved– a také viru vztekliny. Zásadní odlišností od těchto virů se zdá být zvláštní tendence k růstu do délky.“
DOI: 10.1055/s-0028-1106144

Podle Seigerta vypadaly pozorované částice morfologicky jako „viry“ vezikulární stomatitidy, coval, egtved a vztekliny. Hlavní rozdíl byl v délce částic. Opravdu se tyto „viry“ od sebe tolik liší délkou částic? Mohly by to všechno být náhodné kousky ze stejných dlouhých vláken, které se rozpadly, nebo dokonce vznikly při postupech používaných k pořízení snímků? Níže jsou uvedeny snímky „viru“ marburg poskytnuté Seigertem, které ukazují některé delší částice smíchané s jinými menšími částicemi, které připomínají tvar projektilu výše uvedených „virů“ uvedených v jeho článku. Třetí obrázek je obrázek, který poskytl Slenczka a který údajně pochází z původního „izolátu“ z roku 1967, zatímco kolorované obrázky jsou obrázky převzaté z nedávných článků z roku 2022 o případech „viru“ marburg v Ghaně:

Jak je vidět, „virus“ marburg se vyskytuje v různých tvarech a velikostech, od dlouhých vláknitých částic přes menší částice podobné projektilům až po struktury připomínající „korónu“. Zdá se, že podoba „viru“ silně závisí na způsobu pořízení/ořezu snímků a také na tom, jak jsou částice obarveny a kolorovány. Níže jsou uvedeny obrázky „virů“, které jsou podle Seigerta morfologicky podobné „viru“ marburg.

Vezikulární stomatitida

Na těchto snímcích „viru“ vezikulární stomatitidy můžeme vidět podobný tvar připomínající projektil, jaký je vidět na částicích, o nichž se tvrdí, že jsou „virem“ vztekliny. Zajímavé je, že částice mají různou velikost, od menších projektilů až po mnohem protáhlejší formy připomínající „virus“ marburg. Toto „rozvinutí“ bylo popsáno na třetím snímku jako pravděpodobný důsledek postupů negativního barvení provedených za účelem vizualizace „virových“ částic.

Virus virové hemoragické septikémie (VHSV)

VHSV je „virus“ ryb, který má údajně stejný tvar jako „virus“ vztekliny a morfologicky se podobá „viru“ marburg. Jak je vidět, tvary částic se opět pohybují od malých částic podobných projektilům až po delší vlákna, což je možná opět způsobeno postupy negativního barvení.

Vzteklina

Dokonce i „virus“ vztekliny, který se na snímcích z transmisního elektronového mikroskopu popisuje jako částice tvaru projektilu, vykazuje různé tvary a velikosti v závislosti na barvení a kolorování. Některé z nich se jeví jako dlouhá vlákna podobná „viru“ marburg, která se při zobrazování náhodou vyskytují ve tvaru písmene U. Je zajímavé, že až do počátku 80. let 20. století byl „virus“ marburg klasifikován jako rhabdovirus kvůli podobné morfologii „virů“. Původně dokonce dostal přezdívku Rhabdovirus simiae.

I když je snadné vidět podobnost mezi „virem“ marburg a ostatními „viry“, na které Seigert ve své studii upozornil, nezmínil se o tom, že podobně vypadající vláknité částice můžeme najít i u mnoha dalších „virů“:

Příušnice

Spalničky

Parainfluenza

Je vidět, že snímky těchto částic, o nichž Seigert tvrdí, že jsou různými „viry“, mají podobnou morfologii (tj. tvar a strukturu). Je zřejmé, že barvení a kolorování částic i způsob jejich zvětšení a prezentace rozhodně ovlivňují to, jak se na snímcích jeví. V jedné studii se dokonce uvádí, že postupy negativního barvení mají vliv na to, jak částice vypadají. Při začlenění snímků vláknitých forem jiných „virů“ je zřejmé, že se jedná o další případ, kdy jsou z nepurifikovaného moře částic různých tvarů a struktur vybrány stejné částice (pozorované v různých stádiích tvorby/rozpadu) a považovány za reprezentativního viníka mnoha onemocnění.

Vzhledem k tomu, že snímky z elektronového mikroskopu hrají tak klíčovou roli v důkazu poskytnutém pro „virus“ marburg, je důležité získat lepší vhled do procesu elektronové mikroskopie, který Werner Slenczka a spol. použili k identifikaci „viru“ marburg. Za tímto účelem se nyní zaměříme na jeho článek z roku 2017, v němž popisuje, jak jeho výzkum „filoviru“ začal. V tomto popisu se dozvídáme, že vzorky krve odebrané morčatům byly před zobrazením smíchány s glutaraldehydem a formaldehydem. Slenczka připustil, že hledání neznámého patogenního agens pod elektronovým mikroskopem může být únavné a frustrující, protože ve vzorku lze nalézt mnoho kontaminantů. Tak tomu bylo i v případě „viru“ marburg, protože ve vzorku byly přítomny četné mikrobiální kontaminanty (byl tedy nepurifikovaný a nebyl izolovaný), což ztěžovalo interpretaci dat. Jak již bylo uvedeno, sleziny a játra morčat byly použity pro zobrazení elektronovým mikroskopem s využitím přímé a nepřímé fluorescence protilátek a vzorky byly vysušeny na vzduchu a fixovány ledově studeným acetonem. Protože nevěděli, zda nebude neznámý původce acetonem usmrcen, Slenczka tvrdil, že s preparáty zacházeli velmi opatrně. První výsledky se jim podařilo získat až po 3 týdnech usilovné práce. Slenczka uvedl, že to, co viděl na preparátech, se podobalo Negriho tělískům, která jsou údajně specifická pro „virus“ vztekliny, přesto mu tento nález nějak napověděl, že tento jev je následkem nového „viru“. Svá počáteční zjištění použil k tomu, aby označil každý vzorek morčete s těmito inkluzemi jako vzorek s „virem“, který potřebuje další analýzu pomocí elektronové mikroskopie.

Vzorky krve, které byly vybrány pro další analýzu, byly opět ošetřeny glutaraldehydem a formaldehydem a studovány. Dr. D. Peters, spolu se svým technikem, strávil více než den zkoumáním vzorků bez jakýchkoli výsledků. Druhý den dr. Peters přerušil hledání kvůli polední přestávce a předal vedení dr. G. Müllerovi. Jakmile se dr. Peters vrátil z polední přestávky, dr. Müller mu oznámil, že „virus“ byl nalezen (za necelou hodinu), neboť našli neznámé částice odlišné morfologie a struktury, než jaké byly pozorovány dříve. Je zřejmé, že tomu tak není, protože stejné částice byly pozorovány u různých jiných „virů“, jak bylo podrobně popsáno výše. Celý proces „izolace“ nezahrnoval purifikaci a izolaci žádného „viru“ přímo z lidských tekutin a místo toho se zcela opíral o domněnky založené na nepřímých důkazech získaných ze studií na zvířatech, antigenech a elektronové mikroskopii za použití nepurifikovaného a neizolovaného materiálu spíše od morčat než od lidí.

Zajímavé je, že vzhledem k tomu, že laboratorní výzkumníci, kteří byli původně „infikováni“ „virem“, prováděli výzkum vakcíny proti dětské obrně za použití buněčných kultur opičích ledvin, předpokládalo se, že „virus“ pochází z dovezených opic. Podle Slenczky však žádná z opic v žádné z laboratoří na žádném místě nikdy nevykazovala známky onemocnění. Rovněž uvedl, že přesné údaje o letalitě inkriminovaných opic nebyly nikdy sděleny. Zůstalo tedy na pouhých domněnkách, že některé trvale nakažené opice z „Opičího ostrova“, které byly umístěny v klecích pro výzkum, mohly být zdrojem zavlečení „viru“ marburg do Evropy. Podle Slenczky bylo známo, že velké množství opic ze stejného zdroje v Ugandě bylo ve stejné době převezeno do Švédska, Japonska, Československa, Itálie, Švýcarska a Anglie za účelem přípravy buněčných kultur. Na žádném z těchto míst však nebyla hlášena žádná ohniska nákazy. Slenczka tak byl nucen přiznat, že jeho hypotéza, stejně jako jeho „virus“, byly založeny pouze na domněnkách:

Výzkum filovirů: Jak to začalo

„Tyto experimenty byly krokem správným směrem, ale původce zůstal neidentifikován. Pro usnadnění identifikace byla krev nakažených zvířat, odebraná v době kulminace onemocnění, smíchána s glutaraldehydem a formaldehydem, aby se neznámý původce inaktivoval a konzervoval, a odeslána k analýze do laboratoří elektronové mikroskopie na univerzitě v Marburgu a do Institutu Bernharda Nochta pro tropickou medicínu v německém Hamburku: Dr. D. Peters, vedoucí oddělení virologie v Institutu Bernharda Nochta, byl uznávaným odborníkem na elektronovou mikroskopii virů a měl velké zkušenosti s analýzou virových struktur.

Hledání neznámého patogenu v biologických materiálech pomocí elektronové mikroskopie může být samozřejmě nesmírně únavné a – v případě negativního výsledku – velmi frustrující.

V případě materiálu z morčat se brzy objevila další překážka. Závažnou komplikací, se kterou se při hledání neznámých patogenů často setkáváme, je kontaminace organismy, které s daným onemocněním nesouvisejí. Tyto ‚přidružené‘ kontaminanty mohou interferovat s etiologickým agens, nebo mohou dokonce samy způsobit onemocnění. Ke kontaminaci může dojít v důsledku již existující infekce. Během přenosu na další zvířata mohou být kontaminanty přeneseny s vyšší účinností než neznámé etiologické agens. Riziko kultivace kontaminujícího agens lze snížit použitím zvířat z SPF (bez specifických patogenů) chovu. V roce 1967 nebylo možné v Marburgu morčata z SPF chovu sehnat. Namísto toho byla zvířata zakoupena z místních chovných stanic, které nekontrolovaly infekce. Proto se při pokusech prováděných dr. Siegertem a Shuem stalo, že v morčatech byla přítomna mikrobiální kontaminace, včetně pseudomonád, pasteurel a v některých případech paramyxovirů. I když bylo zcela jasné, že tyto dobře známé organismy nejsou etiologickým patogenem, přítomnost těchto kontaminantů komplikovala interpretaci údajů.“

„Orgány z infikovaných i neinfikovaných morčat, zejména játra a slezina, byly použity k vytvoření otiskových preparátů na mikroskopických sklíčkách, které byly následně vysušeny na vzduchu a fixovány ledově studeným acetonem. Vzhledem k tomu, že jsme nevěděli, zda neznámý původce nebude acetonem usmrcen, zacházeli jsme s těmito sklíčky velmi opatrně. Trvalo 3 týdny usilovné práce, než jsme získali první výsledky. V jaterních buňkách infikovaného morčete jsem našel zářivě fluoreskující cytoplazmatické inkluze. Protože všechny kontroly byly negativní, byl jsem si jistý, že jsem našel antigenní struktury neznámého patogenu. V té době ještě nebylo možné říci, zda tyto inkluze, které připomínaly Negriho tělíska nalezená v buňkách infikovaných virem vztekliny (Goldwasser a kol. 1959), svědčí o virové nebo bakteriální infekci. Bylo však jasné, že jsem objevil něco, co nikdo předtím neviděl; struktury neznámého agens způsobujícího smrtelnou nemoc (Slenczka a kol. 1968).

Pomocí tohoto testu bylo nyní možné identifikovat zvířata, která byla tímto agens infikována, a vybrat tak materiál pro vyšetření pomocí elektronového mikroskopu. Krev morčat ošetřená glutaraldehydem a formaldehydem byla opět zaslána do Institutu Bernharda Nochta v Hamburku k analýze pomocí elektronového mikroskopu. Dr. D. Peters spolu s technikem analyzovali negativně obarvený materiál více než jeden den, ale nepozorovali nic, co by připomínalo virus. Druhý den pátrání odešel dr. Peters z laboratoře na polední přestávku a předal vzorek svému spolupracovníkovi dr. G. Müllerovi a požádal ho, aby pokračoval v pátrání. Za necelou hodinu se dr. Müllerovi podařilo najít virové částice, které byly díky své velikosti a jedinečné morfologii identifikovány jako produkty neznámého viru. Když se dr. Peters vrátil z polední přestávky, dr. Müller mu nový virus ukázal. Není jasné, proč dr. Peters při zkoumání vzorků tyto virové částice nenašel. Nejpravděpodobnějším vysvětlením se zdá být to, že částice samovolně sedimentovaly na dno zkumavky a dr. Peters odebral materiál pouze z horní části.“

„Výzkumníci, kteří si zaslouží uznání za izolaci a identifikaci viru marburg, jsou Walter Mannheim z univerzity v Marburgu za úspěšný přenos na morčata, Werner Slenczka z univerzity v Marburgu za detekci a identifikaci antigenu viru marburg pomocí imunofluorescenční analýzy a Gerhard Müller z Institutu Bernharda Nochta za identifikaci viru pomocí elektronové mikroskopie. Walter Mannheim, bakteriolog, neměl zájem o spoluautorství publikací, přestože se podílel na izolaci viru.“

„Nejzajímavější otázkou ohledně těchto opic je jejich zdravotní stav. Kde a v jaké době virus získaly? Proč na žádném místě nevykazovaly příznaky nemoci; ani když byly v Entebbe, ani po příjezdu do Londýna, Frankfurtu, Marburgu nebo Bělehradu, ani když byly nakonec utraceny? Letalita u importovaných primátů byla v té době asi 5%. Zvýšená letalita dovezených primátů by jistě měla vzbudit podezření. Přesné údaje o letalitě inkriminovaných opic nebyly nikdy sděleny. Není pochyb o tom, že zvířata byla před použitím pečlivě prohlédnuta.“

„Předpoklad, že některé trvale infikované opice z ‚Opičího ostrova‘ mohly být zdrojem pro zavlečení viru marburg do Evropy, by mohl pomoci vysvětlit některé zvláštnosti tohoto ohniska. Je známo, že velké množství opic ze stejného zdroje v Ugandě bylo přepraveno do Švédska, Japonska, Československa, Itálie, Švýcarska a Anglie ve stejnou dobu a za stejným účelem: k přípravě buněčných kultur. Na žádném z těchto míst však nebylo hlášeno ohnisko nákazy. Je možné, že při kompletaci zásilek do Německa a do Jugoslávie nezbyl ve sběrné stanici dostatek opic, a proto byla k doplnění zásilky použita zvířata z ‚Opičího ostrova‘. Mezi zvířaty odchycenými na ‚Opičím ostrově‘ byla možná i zvířata, která přežila infekci virem marburg, ale zdála se být zdravá. To by mohlo vysvětlovat, proč byl virus marburg přepraven výhradně se zásilkami do míst v Německu a v Jugoslávii.

Je třeba přiznat, že výše formulovaná hypotéza je založena na domněnkách. Nabízí však zajímavé vysvětlení, které řeší mnoho otevřených otázek týkajících se této epidemie, jež dosud zůstávaly nezodpovězeny.“

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28766193/

3. Buněčné kultury

„V buněčných kulturách se cytopatické změny nevyskytují. Již třetí den však mohou být rozpoznány inkluze cytoplazmatického antigenu, jejichž počet a velikost se výrazně zvyšuje až do 7. dne.“

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-01593-3_22

Kromě problémů spojených s interpretací kontaminovaných a nepurifikovaných vzorků na snímcích z elektronového mikroskopu a nepřítomnosti onemocnění u opic, o nichž se předpokládalo, že jsou nositeli „viru“, selhaly i první pokusy o pomnožení „viru“ na buněčných kulturách. Bylo použito mnoho různých buněčných linií a často byly získány protichůdné výsledky. Vědci mnohokrát tvrdili, že se „virus“ v buňkách úspěšně replikuje, přestože požadovaný cytopatický efekt nebyl pozorován. To je efekt, na základě kterého virologové tvrdí, že strukturální změny pozorované v hostitelské buňce během kultivace jsou výsledkem „virové“ infekce a replikace. Jak uvedl jeden zdroj, cytopatický efekt je způsob, jak „pozorovat“ a nepřímo měřit „virovou“ infekci tím, že se podíváme na poškození, které „virus“ v buňce způsobil. Toto poškození je měřítkem, které se běžně používá ve virologických laboratořích po celém světě k nepřímému určení přítomnosti „viru“. Bez pozorování takového efektu by kultivace měla teoreticky ukázat, že ve vzorku není přítomen žádný „virus“. Protože však tento efekt není vždy pozorován, virologové našli způsob, jak obejít nemožnost vyvolat tento efekt ve všech kulturách, a to tvrzením, že některé „viry“ neprodukují cytopatický efekt vůbec, zatímco jiné pouze v určitých buněčných liniích. Uvádějí, že i bez pozorování cytopatického efektu jsou kultivace stále úspěšné, navzdory absenci jakýchkoli strukturálních změn, které by znamenaly napadení buňky „virem“ a následný proces replikace.

Níže uvedené citace jsou ze studie z roku 1971, která shrnuje pokusy o kultivaci „viru“ marburg a vysvětluje matoucí a rozporuplné výsledky. Autoři dospěli k závěru, že „virus“ sice bylo možné množit v kultuře, ale obecně platilo, že nebylo možné pozorovat žádné výrazné cytopatické změny:

Kultivace viru marburg (Rhabdovirus simiae) na buněčných kulturách

„V době, kdy původce hemoragické horečky marburg ještě nebyl znám, byly podniknuty pokusy o izolaci původce od pacientů. Pro účely izolace byla použita laboratorní zvířata a mnoho buněčných systémů, ale všechny počáteční pokusy na buněčných kulturách byly neúspěšné (SIEGERT a kol., 1967; MAY a KNOTHE, 1968; SIEGERT a kol., 1968). Později, když byl virus izolován u morčat (SIEGERT a kol., 1967; SMITH a kol., 1967; KUNZ a kol., 1968; MAY a KNOTHE, 1968; KISSLING a kol., 1968), se mnoho výzkumníků pokoušelo pomnožit virus marburg na různých buněčných kulturách. V současné době je k dispozici mnoho údajů, které budou shrnuty v této zprávě.“

„SIEGERT a kol. (1968) zjistili, že v primárních buňkách ledvin kočkodanů (Cercopithecus), druhu, s nímž byl původce zavlečen do Německa, se virus replikuje bez cytopatického efektu. Prokázali také specifický antigen viru pomocí imunofluorescenční metody. Naopak HAAS a kol. (1968) pozorovali u primárních buněk ledvin kočkodanů výrazný cytopatický efekt. Tyto buňky byly pouze méně citlivé na virus než subkutánně infikovaní kočkodani.

V primárních buňkách ledvin opic Rhesus se virus replikoval, ale bez cytopatického efektu (HOFMANN a KUNZ, 1968). Virus se množil rovněž na primárních buňkách lidského původu. MAY a KNOTHE (1968) nemohli pozorovat cytopatický efekt v lidských leukocytech, ale zaznamenali mírný cytopatický efekt v primárních lidských amniových buňkách (MAY a kol., 1968).

Replikaci viru jsme mohli prokázat v primárních fibroblastech embrya morčete, ale nebyl pozorován žádný cytopatický efekt (HOFMANN a KUNZ, 1968).

V buňkách kuřecích embryí jsme zjistili velmi slabou replikaci viru (HOFMANN a KUNZ, 1968), zatímco jiní badatelé nepozorovali vůbec žádné množení (SMITH a kol., 1967; MAY a KNOTHE, 1968).“

„Z hlediska množení viru marburg byly zkoumány také zavedené buněčné linie. Nejprve byly testovány buňky odvozené z opic. Přestože jsme zjistili, že permanentní buňky ledvin kočkodanů (kmen GMK-AHl) produkovaly vysoké titry viru (1 ml kultivační tekutiny obsahoval 10^6 infekčních dávek pro morčata), nepodařilo se nám prokázat žádný cytopatický efekt. KISSLING a kol. (1968) byli úspěšnější; pozorovali cytopatický efekt ve svých kulturách druhý den p.i., což bylo celkově asi 4.–5. den.

V buněčné linii VERO se virus rovněž množil. SIEGERT a kol. (1968) nepozorovali žádný cytopatický efekt a KISSLING a kol. (1968) pouze mírný cytopatický efekt.

Z buněk opic Rhesus umožnily srdeční buňky (kmen CMH) pouze mírný růst viru (HOFMANN a KUNZ, 1968), zatímco v buňkách ledvin (kmen LLC-MK2) nebyla prokazatelná žádná replikace viru (SMITH a kol., 1967).

Ve studiích SMITHE a kol. (1967) se virus marburg množil v L buňkách (buňky myších embryí) bez cytopatického efektu; v těchto buňkách se nepodařilo prokázat žádný růst viru.

Srdeční buňky pocházející z morčat rovněž umožňovaly replikaci viru bez cytopatického efektu (KISSLING a kol., 1968).

První zprávy o cytopatickém efektu vyvolaném virem marburg v buněčných kulturách přinesli ZLOTNIK a kol. (1968). Zjistili, že virus je adaptabilní na buňky BHK21. V první pasáži byla v infikovaných buňkách po 13 dnech pozorována typická inkluzní tělíska podobná těm, která byla nalezena v játrech morčat, a cytopatický efekt se objevil asi 23. den. Po několika pasážích se inkluzní tělíska i cytopatický efekt objevily dříve. V naší laboratoři vykazovaly kultury BHK21 pouze mírné změny, které se objevily velmi pozdě (HOFMANN a KUNZ, 1968). KISSLING a kol. (1968) testovali dva kmeny buněk BHK21. Jeden z nich, kmen WI 2, se choval stejně jako kmen v naší laboratoři, ale druhý byl vysoce citlivý. Cytopatický efekt byl pozorován přibližně 2.–5. den po infekci.

Na rozdíl od 3 dalších týmů výzkumníků (SIEGERT a kol., 1968; SMITH a kol., 1967; MAY a KNOTHE, 1968) jsme mohli virus marburg v našem kmeni HeLa množit poměrně dobře. Jeden ml kultivační tekutiny obsahoval 10⁴ infekčních částic pro morčata, nicméně jsme nezjistili žádný cytopatický efekt (HOFMANN a KUNZ, 1968).

Na cytopatický efekt vyvolaný virem marburg byly testovány i další kmeny pocházející z lidských zdrojů. KISSLING a kol. (1968) množili virus ve fibroblastech předkožky. Při první pasáži viru byl cytopatický efekt prokazatelný, ale v sériových pasážích jej nebylo možné reprodukovat. V buňkách U, stabilní buněčné linii lidského amnia, se původce rovněž replikoval, ale bez cytopatického efektu (HOFMANN a KUNZ, nepublikováno).

V naší laboratoři jsme již dříve testovali mnoho buněčných systémů, ale nepodařilo se nám zjistit buněčnou linii, ve které by se virus marburg množil za tvorby cytopatického efektu. Nakonec jsme narazili na buněčný kmen ELF (embryonální lidské plicní fibroblasty), u kterého se cytopatický efekt objevuje přibližně 3. den a dosahuje maxima přibližně 5. den po infekci. Cytopatický efekt začíná v ohniskových oblastech a spočívá ve vřetenovitosti a později ve shlukování buněk. Ohniska nakonec splývají. Je třeba zmínit, že ačkoli jsou změny závažné, nikdy nejsou úplné a nakonec do nich mohou vrůst zdravé buňky a léze opravit.“

„Shrneme-li někdy protichůdné výsledky získané různými výzkumníky, lze konstatovat, že buňky pocházející ze savců, jako jsou opice, morčata a křečci, a lidské buňky jsou vůči viru vnímavé. Buňky často produkovaly vysoké titry, i když zpravidla nebylo možné pozorovat žádné výrazné cytopatické změny.“

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-01593-3_15

SHRNUTÍ:

• „Virová“ choroba marburg je údajně vzácná, ale závažná hemoragická horečka, která postihuje jak lidi, tak primáty.
• „Virus“ marburg je jedním ze sedmi druhů „virů“ patřících do čeledi Filoviridae, přičemž jedinými dalšími známými členy skupiny „filovirů“ je šest druhů viru ebola.
• „Virus“ marburg byl poprvé rozpoznán v roce 1967, kdy se současně objevila ohniska hemoragické horečky v laboratořích v Marburgu a Frankfurtu v Německu a v Bělehradě v Jugoslávii (nyní Srbsko).
• První „nakažení“ byli při výzkumu vystaveni kočkodanům dovezeným z Ugandy nebo jejich tkáním.
• Klinická diagnóza virové choroby marburg může být obtížná, protože mnoho jejích příznaků je podobných jiným infekčním onemocněním (jako je malárie, břišní tyfus nebo horečka dengue) nebo „virovým“ hemoragickým horečkám, které se mohou v dané oblasti endemicky vyskytovat (jako je horečka Lassa nebo ebola).
• První pacienti byli léčeni doma po dobu až 10 dní, i když onemocnění podle popisu začínalo náhle extrémní malátností, bolestí svalů, bolestí hlavy a rychlým zvýšením teploty až na 39 °C a více.
• Přestože klinické příznaky nebyly během prvních 3–4 dnů příliš znepokojivé, na konci prvního týdne se objevily další příznaky a projevy.
• Gastrointestinální příznaky, jako je nevolnost, zvracení a průjem, lékařům naznačovaly, že diagnózou může být úplavice nebo břišní tyfus.
• V některých případech pacienti zemřeli na těžký hemoragický šok den po přijetí do nemocnice.
• Všimněte si, že neexistují žádné informace o tom, jakou léčbu (která mohla jejich klinické příznaky zhoršit) pacienti podstoupili před a po přijetí do nemocnice.
• K přenosu nákazy vzduchem mezi lidmi nedošlo, jak naznačuje např. případ mladého muže, který spal se svým bratrem v jedné posteli jen několik dní před jeho smrtí; u bratra se onemocnění nerozvinulo a o 6 měsíců později byl na virus marburg séronegativní.
• Jeden z pacientů byl v době propuknutí nákazy těžce nemocný, ale z neznámých důvodů nebyl hospitalizován a uzdravil se a o 15 let později tvrdil, že byl nakažen virem marburg (úplné uzdravení z těžké nemoci bez hospitalizace/léčby… 🤔).
• V polovině září bylo zřejmé, že původce vykazuje nízkou nakažlivost.
• Vyskytlo se pouze několik případů sekundární infekce a žádný případ terciární infekce a během předchozích dvou týdnů se nevyskytly žádné nové případy.
• Rudolf Siegert provedl pokusy s morčaty a zjistil, že původce se může přenášet mezi morčaty a vykazuje patogenitu, která se zvyšuje od pasáže k pasáži (tj. čím více morčatům injekčně aplikovali chorobnou břečku a tkáně z kultivace, tím více morčata onemocněla).
• Všechny pokusy o určení etiologického agens pomocí světelné nebo elektronové mikroskopie však selhaly a hlavním problémem byly oportunní bakteriální infekce.
• Jinými slovy, tvrdili, že uvnitř toxické břečky, kterou sériově pasážovali a injekčně aplikovali morčatům, byl „virus“, ale nemohli ho najít.
• Po tomto neúspěchu byly k dispozici vzorky lidského a morčecího rekonvalescentního séra a některé vzorky séra byly označeny fluoresceinem pro test přímé imunofluorescence.
• O tři týdny později zjistil W.S. pomocí přímé imunofluorescence intracytoplazmatické inkluze v tkáních infikovaných morčat.
• Plazma ošetřená formalínem byla pomocí nové techniky vyvinuté Gerhardem Müllerem odstředěna přímo na mřížky elektronového mikroskopu a bylo provedeno negativní barvení.
• Pomocí těchto metod byl virus marburg identifikován 20. listopadu 1967, téměř 3 měsíce po vypuknutí nákazy.
• Při pokusech na morčatech byla sražená krev hemolyzována sterilní destilovanou vodou a orgány byly rozmělněny pomocí hmoždíře a ředícího roztoku fosfátového pufru obsahujícího 10 p. 100 normálního králičího séra tak, aby konečná koncentrace činila asi 20 % objemu.
• Sající myši byly inokulovány intracerebrálně (ic) a intraperitoneálně (ip) 0,02 ml směsi, zatímco morčata (200–300 g) byla inokulována intraperitoneálně dávkou 4 ml.
• Pro další pasážování byla intraperitoneálně aplikována plná krev odebraná srdeční punkcí.
• Všechny pokusy o izolaci byly negativní s výjimkou morčat.
• U morčat, kterým byly intraperitoneálně injekčně aplikovány vzorky krve pacienta H. F. (HF 1 a HF 2), orgánové suspenze pacienta P. S. a směsné vzorky orgánů kočkodanů M 10 a M 14, se 4 až 6 dní po inokulaci konzistentně objevovala febrilní reakce (tzn. horečka).
• Plná krev odebraná během této febrilní fáze byla úspěšně pasážována intraperitoneálně u morčat po 3 až 6 pasážích.
• Inkubační doba se zkrátila na 2 až 3 dny a některá morčata uhynula 7 až 17 dní po inokulaci.
• Klinické příznaky u zvířat byly:
  • Ztráta chuti k jídlu a ztráta hmotnosti
  • „Nafouklý obličej“
  • Zvětšení varlat
• Výzkumníci se domnívali, že uvedené výsledky ukazují, že z lidského a opičího materiálu byl „izolován“ organismus, který byl u morčat přenesen čtyřmi až šesti pasážemi.
• Jinými slovy, opakovaná injekční aplikace nemocných tkání a tekutin morčatům a vyvolání příznaků se rovnaly „izolaci viru“.
• Na základě vyhledávání „viru“ pomocí elektronové mikroskopie popsal Rudolf Siegert pozorované částice jako morfologicky blízce příbuzné „viru“ vezikulární stomatitidy, coval, egtved– a „viru“ vztekliny.
• Zásadní odlišností od těchto „virů“ se zdála být zvláštní tendence k růstu do délky.
• Za účelem identifikace částic „viru“ pod elektronovým mikroskopem byla krev nakažených zvířat, odebraná v době kulminace onemocnění, smíchána s glutaraldehydem a formaldehydem, aby se neznámý původce inaktivoval a konzervoval.
• Werner Slenczka připustil, že hledání neznámého patogenu v biologických materiálech pomocí elektronové mikroskopie může být nesmírně únavné (což by se v případě purifikovaného/izolovaného preparátu nestalo).
• Závažnou komplikací, se kterou se při hledání neznámých patogenů výzkumníci často setkávají, je kontaminace organismy, které s daným onemocněním nesouvisejí.
• Tyto „přidružené“ kontaminanty mohou interferovat s etiologickým agens, nebo mohou dokonce samy způsobit onemocnění.
• Během přenosu na další zvířata mohou být kontaminanty přeneseny s vyšší účinností než neznámé etiologické agens.
• V roce 1967 nebylo možné v Marburgu sehnat speciální morčata bez patogenů, takže zvířata byla zakoupena z místních chovných stanic, které nekontrolovaly infekce.
• Proto se při pokusech prováděných dr. Siegertem a Shuem stalo, že v morčatech byla přítomna mikrobiální kontaminace, včetně pseudomonád, pasteurel a v některých případech „paramyxovirů“.
• Přítomnost těchto kontaminantů komplikovala interpretaci údajů.
• Vzorky byly vysušeny na vzduchu a fixovány ledově studeným acetonem, ale jelikož výzkumníci nevěděli, zda neznámý původce nebude acetonem usmrcen, zacházeli s těmito preparáty velmi opatrně.
• Trvalo 3 týdny usilovné práce, než získali první výsledky.
• Slenczka našel ve vzorcích inkluze, které připomínaly Negriho tělíska, jež se nacházejí v buňkách „nakažených virem“ vztekliny.
• Nález stejných inkluzí, jaké byly pozorovány u vztekliny, z nějakého důvodu vedl Slenczku k přesvědčení, že se jedná o následek nového „viru“.
• Dr. D. Peters spolu s technikem analyzovali negativně obarvený materiál více než jeden den, ale nepozorovali nic, co by připomínalo „virus“.
• Druhý den pátrání odešel dr. Peters z laboratoře na polední přestávku a předal vzorek svému spolupracovníkovi dr. G. Müllerovi a požádal ho, aby pokračoval v pátrání a za necelou hodinu se dr. Müllerovi podařilo najít „virové“ částice, které byly díky své velikosti a jedinečné morfologii identifikovány jako produkty neznámého „viru“.
• Připomeňme, že bylo uvedeno, že „virus“ marburg se morfologicky podobal mnoha jiným „virům“, včetně „viru“ vztekliny.
• Není jasné, proč dr. Peters při zkoumání vzorků „virové“ částice nenašel.
• Podle Slenczky jsou vědci, kteří si zaslouží uznání za „izolaci“ a identifikaci „viru“ marburg:
  • Walter Mannheim z univerzity v Marburgu za úspěšný přenos na morčata (neměl zájem o spoluautorství publikací, přestože se podílel na izolaci „viru“)
  • Werner Slenczka z univerzity v Marburgu za detekci a identifikaci antigenu „viru“ marburg pomocí imunofluorescenční analýzy
  • Gerhard Müller z Institutu Bernharda Nochta za identifikaci viru pomocí elektronové mikroskopie

• Všimněte si, že celý proces „izolace“ nezahrnoval purifikaci a izolaci žádného „viru“ přímo z lidských tekutin a místo toho se zcela opíral o domněnky založené na nepřímých důkazech získaných ze studií na zvířatech, antigenech a elektronové mikroskopii za použití nepurifikovaného a neizolovaného materiálu od morčat.
• Protože laboratorní pracovníci, kteří onemocněli, pracovali na výzkumu dětské obrny s použitím buněčných kultur opičích ledvin, předpokládalo se, že se nakazili od dovezených opic.
• Žádná z opic však na žádném místě nevykazovala příznaky onemocnění.
• Přesné údaje o letalitě inkriminovaných opic nebyly nikdy sděleny.
• Slenczka předpokládal, že některé trvale infikované opice z „Opičího ostrova“ mohly být zdrojem pro zavlečení „viru“ marburg do Evropy.
• Bylo známo, že velké množství opic ze stejného zdroje v Ugandě bylo přepraveno do Švédska, Japonska, Československa, Itálie, Švýcarska a Anglie ve stejnou dobu a za stejným účelem: k přípravě buněčných kultur.
• Na žádném z těchto míst však nebylo hlášeno ohnisko nákazy.
• Slenczka připustil, že jím formulovaná hypotéza byla založena na domněnkách.
• Jak již bylo uvedeno, pokusy o izolaci „viru“ z lidských pacientů selhaly.
• Pro účely izolace byla použita laboratorní zvířata a mnoho buněčných systémů, ale všechny počáteční pokusy na buněčných kulturách byly neúspěšné.
• Teprve když byl „virus“ „izolován“ u morčat, byly provedeny další pokusy o kultivaci „viru“.
• Mnoho výzkumníků se pokoušelo pomnožit „virus“ marburg na různých buněčných kulturách.
• Siegert a kol. (1968) zjistili, že v primárních buňkách ledvin kočkodanů (Cercopithecus), druhu, s nímž byl původce zavlečen do Německa, se „virus“ replikuje bez cytopatického efektu.
• Naopak Haas a kol. (1968) pozorovali u primárních buněk ledvin kočkodanů výrazný cytopatický efekt.
• V primárních buňkách ledvin opic Rhesus se „virus“ replikoval, ale bez cytopatického efektu (Hofmann a Kunz, 1968).
• „Virus“ se množil rovněž na primárních buňkách lidského původu, ale May a Knothe (1968) nemohli pozorovat cytopatický efekt v lidských leukocytech, ale zaznamenali mírný cytopatický efekt v primárních lidských amniových buňkách (May a kol., 1968).
• Hofmann a Kunz byli schopni prokázat replikaci „viru“ v primárních fibroblastech embrya morčete, ale nebyl pozorován žádný cytopatický efekt.
• V buňkách kuřecích embryí Hofmann a Kunz zjistili velmi slabou replikaci „viru“, zatímco jiní badatelé nepozorovali vůbec žádné množení (Smith a kol., 1967; May a Knothe, 1968).
• Přestože Hofmann a Kunz zjistili, že permanentní buňky ledvin kočkodanů (kmen GMK-AHl) produkují vysoké titry „viru“, nepodařilo se jim prokázat žádný cytopatický efekt.
• Kissling a kol. (1968) byli úspěšnější; pozorovali cytopatický efekt ve svých kulturách druhý den p.i., což bylo celkově asi 4.–5. den.
• V buněčné linii VERO se „virus“ rovněž množil, zatímco Siegert a kol. (1968) nepozorovali žádný cytopatický efekt a Kissling a kol. (1968) pouze mírný cytopatický efekt.
• Z buněk opic Rhesus umožnily srdeční buňky (kmen CMH) pouze mírný růst „viru“ (Hofmann a Kunz, 1968), zatímco v buňkách ledvin (kmen LLC-MK2) nebyla prokazatelná žádná replikace „viru“ (Smith a kol., 1967).
• Ve studiích Smithe a kol. (1967) se „virus“ marburg množil v L buňkách (buňky myších embryí) bez cytopatického efektu, přesto Hofmann a Kunz nemohli v těchto buňkách prokázat žádný růst „viru“.
• Srdeční buňky pocházející z morčat rovněž umožňovaly replikaci „viru“ bez cytopatického efektu (Kissling a kol., 1968).
• První zprávy o cytopatickém efektu „vyvolaném virem“ marburg (zajímavá formulace, protože cytopatický efekt by měl být pouze „vyvolaný virem“) v buněčných kulturách přinesli Zlotnik a kol. (1968), kteří zjistili, že „virus“ je adaptabilní na buňky BHK21.
• Při první pasáži byla v infikovaných buňkách po 13 dnech pozorována typická inkluzní tělíska podobná těm, která byla nalezena v játrech morčat, a cytopatický efekt se objevil asi 23. den.
• Po několika pasážích se inkluzní tělíska i cytopatický efekt objevily dříve (což ukazuje, že poškození buněk a vznik cytopatického efektu způsobilo pasážování, nikoli „virus“).
• Na rozdíl od tří dalších týmů badatelů (Siegert a kol., 1968; Smith a kol., 1967; May a Knothe, 1968) Hofmann a Kunz tvrdili, že se jim podařilo „virus“ marburg poměrně dobře množit v kmeni HeLa, avšak žádný cytopatický efekt nebyl pozorován.
• Na cytopatický efekt vyvolaný „virem“ marburg byly testovány i další kmeny pocházející z lidských zdrojů, neboť Kissling a kol. (1968) množili „virus“ ve fibroblastech předkožky.
• Při první pasáži „viru“ byl cytopatický efekt prokazatelný, ale v sériových pasážích jej nebylo možné reprodukovat.
• V buňkách U, stabilní buněčné linii lidského amnia, se původce rovněž replikoval, ale bez cytopatického efektu (Hofmann a Kunz, nepublikováno).
• Hofmann a Kunz předtím testovali mnoho buněčných systémů, ale nebyli schopni odhalit buněčnou linii, ve které by se „virus“ marburg množil za tvorby cytopatického efektu, dokud nenarazili na buněčný kmen ELF (embryonální lidské plicní fibroblasty), u kterého se cytopatický efekt objevuje přibližně 3. den a dosahuje maxima přibližně 5. den po infekci.
• Připustili však, že ačkoli jsou změny závažné, nikdy nejsou úplné a nakonec do nich mohou vrůst zdravé buňky a léze opravit.
• Po shrnutí někdy protichůdných výsledků získaných různými výzkumníky bylo konstatováno, že buňky pocházející ze savců, jako jsou opice, morčata a křečci, a lidské buňky jsou vůči „viru“ vnímavé, neboť buňky často produkovaly vysoké titry, i když zpravidla nebylo možné pozorovat žádné výrazné cytopatické změny.

V současnosti žijeme v době, kdy se v různých částech světa údajně objevují nové i staré známé „viry“. Každé z těchto ohnisek je médii prezentováno jako potenciální epidemie/pandemie, která čeká na propuknutí, když ne teď, tak určitě v blízké budoucnosti. Na tuto možnost jsme neustále připravováni. Zajímavé je, že většina těchto nemocí sdílí stejné nespecifické příznaky, včetně onemocnění podobného chřipce a nějaké formy vyrážky. Zdá se, že tyto nemoci se u pacientů projevují netypickým způsobem v zemích, které nejsou endemickými oblastmi, kde pacienti v minulosti necestovali do známých ohnisek ani nepřišli do styku se zvířaty, o nichž se předpokládá, že jsou přenašeči „viru“. Vzhledem k tomu, že klinická diagnóza není kvůli překrývajícím se příznakům možná, k vytváření případů se používají podvodné testy PCR.

Jako poslední z tohoto „virového“ kolotoče se objevil „virus“ marburg. Podle mainstreamových médií má nákaza tímto „vysoce nakažlivým virem“ potenciál ve světě propuknout, pokud se tomu okamžitě nezabrání, přestože není známa žádná léčba ani vakcína, které by proti němu byly úspěšné. Při nedávném „propuknutí“ v Ghaně se nakazili čtyři lidé, zatímco při předchozím „propuknutí“ v Guineji v roce 2021 jen jeden člověk. K dnešnímu dni bylo na celém světě od „objevení“ „viru“ marburg v roce 1967 zaznamenáno celkem 475 případů. Jedná se skutečně o „vysoce nakažlivý, virulentní a smrtící virus“?

Pohled do historie tohoto „viru“ ukazuje zcela jiný obrázek, než jaký nám předkládají mainstreamová média. Nejenže počáteční výskyt mezi výzkumníky očkování proti dětské obrně nebyl od počátku považován za alarmující, ale pacienti byli navíc léčeni doma až po dobu 10 dní. Ti, kteří byli nakonec přijati do nemocnice, byli ti, kteří nakonec podlehli, někteří již jeden den po přijetí. Jeden pacient, který byl považován za těžce nemocného, nikdy nevyhledal nemocniční ošetření a plně se zotavil. Bez znalosti přesné léčby, která byla pacientům poskytnuta před přijetím do nemocnice a bezprostředně po něm, je třeba se ptát, zda závažnost příznaků pozorovaných u těch, kteří nakonec nemoci podlehli, mohla způsobit jejich léčba?

Ještě přesvědčivějším důkazem, že žádný nový patogen nebyl nikdy zjištěn, je proces objevení nového „viru“. Za prvé, žádný „virus“ nebyl nikdy purifikován ani izolován přímo z tekutin nemocného člověka ani opice. Jediný důkaz, údajně prokazující existenci „viru“ marburg, pochází výhradně z pokusů na morčatech, při nichž se zvířatům injekčně aplikovala a sériově pasážovala nepurifikovaná břečka a tkáně. Po experimentálním vyvolání onemocnění u zvířat byly provedeny nespecifické testy za použití protilátek s cílem nalézt ve slezině a játrech morčat inkluze podobné Negriho tělískům (údajně specifické pro vzteklinu, ale opakovaně se ukázalo, že tomu tak není), a poté byly vzorky krve odeslány na zobrazení elektronovou mikroskopií s cílem „virus“ nalézt. Pátrání po částicích „viru“ bylo zdlouhavé a zkušený výzkumník nebyl zpočátku schopen po dni a půl hledání nic najít. Teprve když odešel na oběd, jeho méně zkušený laboratorní asistent byl schopen „virus“ po necelé hodině hledání najít. Částice podobné vláknům byly vybrány jako představitelé „viru“ marburg kvůli své jedinečnosti a délce. Jak však připustil vedoucí výzkumník Rudolf Siegert, částice byly morfologicky podobné mnoha „virům“, včetně „viru“ vztekliny spojovaného s výše zmíněnými Negriho tělísky. Tyto vláknité formy můžeme najít i u jiných „virů“, jako jsou „viry“ příušnic, spalniček, parainfluenzy a mnoha dalších.

Podle Wernera Slenczky, muže, který se na vytváření těchto snímků z elektronového mikroskopu úzce podílel, byly vzorky kontaminovány mnoha mikroorganismy a dokonce i „paramyxoviry“, které ztěžovaly interpretaci. Uvedl, že hledání „virových“ částic bylo únavné a často frustrující. To potvrzuje, že snímky použité jako důkaz existence „viru“ marburg pocházely z nepurifikovaných, kontaminovaných vzorků, a proto nelze v žádném případě tvrdit, že částice spojené s případy v Marburgu jsou ve skutečnosti vůbec „virem“. Slenczka rovněž přiznal, že opice, o nichž se předpokládalo, že jsou zdrojem „viru“, nikdy neonemocněly a byly použity v jiných laboratořích, v nichž nikdy k žádnému propuknutí nemoci nedošlo.

Ještě zajímavější je, že pokusy o „izolaci“ „viru“ se ukázaly jako neúspěšné. První pokusy o pomnožení „viru“ na buněčných kulturách opakovaně končily tím, že existenci žádného „viru“ neprokázaly. To však výzkumníkům nebránilo v tom, aby pro kultivaci nevyzkoušeli řadu buněčných linií, dokud nezískali výsledky, které chtěli vidět. Po opakovaných pokusech a omylech, které vedly k matoucím, protichůdným a rozporuplným výsledkům, bylo rozhodnuto, že „virus“ marburg se sice může množit na buněčných kulturách, ale bez toho, aby vyvolal cytopatický efekt, který je právě tím kritériem, které virologové používají k nepřímému „pozorování“ toho, že „virus“ se zmocnil buňky, aby se v ní mohl množit.

To, co nám v souvislosti s „virem“ marburg zůstalo, jsou nespecifické příznaky onemocnění spojené s nespecifickými inkluzemi podobnými Negriho tělískům ve tkáních a částice, které jsou údajně jedinečnými „virovými“ strukturami, jenž jsou ve skutečnosti morfologicky podobné mnoha jiným „virovým“ částicím. Máme také „virus“, který se údajně množí na buněčných kulturách, přičemž nevyvolává právě ten efekt, který se hledá pro určení přítomnosti „viru“ ve vzorku. Jinými slovy, „virus“ marburg je dalším z dlouhé řady názvů, které byly dány stejným příznakům onemocnění reprezentovaným stejnými náhodnými částicemi. Je to jen další podvodné divadelní představení, které nám předkládá pseudověda známá jako virologie.