„I když byly původně exozomy ignorovány a uvažovalo se o nich jako o zbytcích buněk, je stále zřejmější, že jejich uvolňování z buněk je regulováno a probíhá způsobem závislým na energii. Předpokládá se, že exozomy transportují proteiny, mRNA a miRNA krevním řečištěm a dalšími tělními tekutinami a chrání je před enzymatickou degradací – což je proces, kterého se mohou některé retroviry zmocnit a využít k tomu, aby se dostaly mimo radar imunitního systému.“
https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/circresaha.113.300636
Během posledních více než dvou let se exozomy staly horkým tématem diskuzí mezi lidmi, kteří zpochybňují existenci „virů“. Je to především zásluhou dr. Andrewa Kaufmana, který na ně upozornil ve svém původním videu zpochybňujícím existenci „SARS-CoV-2“. Přestože se o těchto entitách ví již 40 let, mnoho lidí, včetně mě, o těchto částicích buď nikdy neslyšelo, nebo jim nevěnovalo příliš pozornosti. Dr. Kaufman odvedl skvělou práci, když ukázal, že částice známé jako exozomy jsou přesně těmi samými částicemi spojovanými se „SARS-CoV-2“, jak je vidět na snímcích z elektronového mikroskopu. Dostaly jen jiná jména a funkce.
Mnozí lidé, kteří začali narativ o „viru“ zpochybňovat, díky tomuto novému zaměření se na exozomy nahradili koncept „viru“ konceptem exozomu. Zdálo se jim, že jde jen o záměnu identity. Škodlivé, patogenní „viry“ byly podle nich po celou dobu chybně identifikovány a ve skutečnosti šlo jen o prospěšné exozomy přenášející informace mezi buňkami. I když tito lidé oprávněně zpochybňovali důkazy o existenci „virů“ a také chápali, že stejné částice se používají jako reprezentace jak pro „viry“, tak pro exozomy, tito lidé se upnuli k přesvědčení, že existence exozomů byla vědecky prokázána. Domnívají se, že na rozdíl od „virů“ byly exozomy purifikovány, izolovány, charakterizovány a že jejich funkce byla vědecky prokázána. Nic však nemůže být pravdě vzdálenější.
Exozomy/„viry“: Stejné částice, stejně chybná „věda“
„…virus je plně exozomem ve všech významech tohoto slova.“
Napsal jsem mnoho článků o nemožnosti úplně purifikovat a izolovat exozomy od „virů“ a jiných částic podobné velikosti a hustoty. To je pro výzkum exozomů a „virů“ zásadní problém, protože bez možnosti oddělit částice považované za exozomy od částic, které jsou údajně „viry“, není možné studovat obě částice nezávisle, odlišit je od ostatních částic ani je správně charakterizovat. Na tento problém poukázal článek Extracelulární vezikuly a viry – dvě strany téže mince?:
„Jak si můžeme být jisti, že izolujeme a kvantifikujeme extracelulární vezikuly, a ne obalené viry přítomné ve vzorku? Stejně tak, jak mohou vědci zabývající se viry vědět, zda při výrobě vakcín nedetekují podobně velké nevirové vezikuly nebo prázdné vektory?“
Lidé mají z nějakého důvodu dojem, že exozomy lze úplně oddělit od všeho ostatního. Je sice pravda, že vědci studující exozomy provádějí u svých vzorků důkladnější purifikaci, než jaká se používá při výzkumu „virů“, ale tito vědci běžně přiznávají, že úplného oddělení nelze současnými metodami dosáhnout, a to ani pomocí „zlatého standardu“ ultracentrifugace:
„Není-li konkrétněji definováno, je v současné době prakticky nemožné specificky oddělit a identifikovat extracelulární vezikuly, které nesou virové proteiny, hostitelské proteiny a elementy virového genomu, od obalených virových částic, které nesou stejné molekuly.“
„V dnešní době je téměř nemožným úkolem oddělit extracelulární vezikuly od virů pomocí všeobecně uznávaných metod izolace vezikulů, jako je například diferenciální ultracentrifugace, protože se často, kvůli jejich podobným rozměrům, vyskytují společně v podobě pelet. K překonání tohoto problému navrhly různé studie oddělení extracelulárních vezikulů od virových částic využitím jejich rozdílné migrační rychlosti v hustotním gradientu nebo pomocí přítomnosti specifických markerů, které odlišují viry od extracelulárních vezikulů. Spolehlivá metoda, která by skutečně zaručovala úplné oddělení, však doposud neexistuje.“
„Protože je téměř nemožné oddělit extracelulární vezikuly od virionů biochemickými metodami, nepřítomnost extracelulárních vezikulů se obvykle prokazuje nepřítomností jejich proteinových markerů.“
I když vědci metody purifikace zkombinují, stále nejsou schopni zcela oddělit částice, o nichž se tvrdí, že jsou exozomy, od všeho ostatního. Pokud nejsou schopni oddělit částice, o kterých tvrdí, že jsou exozomy, od „virů“ a jiných podobných částic stejné velikosti, hustoty a morfologie, znamenalo by to, že jakýkoli snímek dotyčných částic z elektronového mikroskopu je k ničemu, protože by potenciálně mohly být čímkoli, jak jsem ukázal v mnoha článcích, které o těchto problematických snímcích pojednávají. Ještě větším problémem však je, že vzhledem k povaze elektronové mikroskopie lze částice zvané exozomy pozorovat pouze v mrtvém stavu. Jelikož nemůžeme nahlédnout do těla, abychom viděli tyto částice při práci, nelze pozorovat ani jejich fungování. Co dělají, nebo zda vůbec v těle kolují, jak je nám prezentováno, se můžeme jen dohadovat, jak je uvedeno v úvodní citaci tohoto článku a také v mnoha dalších zdrojích:
„Exozomy, kdysi považované za biomarkery chorobného stavu, jsou nyní považovány za biologicky aktivní a některé z parakrinních účinků terapie kmenovými buňkami.“
„Za prvé, exozomy jsou považovány za médium pro buněčnou komunikaci a mezibuněčný makromolekulární transport.“
What Are Exosomes and Why Are They Important? (abclonal.com)
„Za prvé se předpokládá, že jsou prostředkem mezibuněčné komunikace a přenosu makromolekul mezi buňkami. Za druhé, v posledním desetiletí byla exozomům přisuzována role při šíření proteinů, lipidů, mRNA, miRNA a DNA a role faktorů přispívajících k rozvoji několika onemocnění. A za třetí byly navrženy jako užitečné vektory pro léčiva, protože jsou složeny z buněčných membrán, a nikoli ze syntetických polymerů, a jako takové jsou hostitelem lépe tolerovány.“
„Navzdory dvaceti rokům výzkumu jsou však samotné základy biologie exozomů v plenkách a o tom, jakou roli hrají v normální buněčné fyziologii, víme jen málo.“https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-016-0268-z
Jak je patrné z výše uvedených zdrojů, předpokládá se, že částice, o nichž se tvrdí, že jsou exozomy, hrají v lidském těle roli mezibuněčné komunikace a roli transportní. Byly jim přiděleny role a navrženy funkce. Ani po desetiletích výzkumu však vědci stále nevědí, co tyto částice dělají. Mají pouze dohady, předpoklady a hypotézy. Částice, nyní nazývané exozomy, totiž původně nebyly považovány za nic jiného než za buněčné zbytky, které vznikají při procesu buněčné smrti známém jako apoptóza:
„Původně se předpokládalo, že jsou ‚buněčným prachem‘ nebo že slouží jako mechanismus, kterým se buňky aktivně zbavují vlastního odpadu.“
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332220304297
Co je apoptóza?
Apoptóza neboli buněčná smrt
Při odumírání buněk dochází k programované buněčné smrti známé jako apoptóza, kdy se buňka začne rozpadat a hroutit, čímž se uvolňují drobné částečky buněčných zbytků a odpadu. Tento proces se dělí na 5 hlavních kroků:
Hlavní kroky apoptózy:
- Buňka se zmenší
- Buňka se fragmentuje
- Cytoskelet se zhroutí
- Rozpadá se jaderný obal
- Buňky uvolňují apoptotická tělíska
Electron Microscopy – Centro Investigación Príncipe Felipe (cipf.es)
Posledním výše uvedeným krokem je uvolnění tzv. apoptotických tělísek. Co jsou apoptotická tělíska?
„Apoptotická tělíska, ‚malé uzavřené váčky‘ obsahující informace a látky z odumírajících buněk, byla dříve považována za pytle na odpadky, dokud se nezjistilo, že jsou schopna dodávat užitečné materiály zdravým přijímajícím buňkám (např. autoantigeny).“
Částice zvané apoptotická tělíska, jejichž velikost se může pohybovat od 50 do 5000 nm, byly považovány za „pytle na odpadky“ obsahující informace z odumírajících buněk, dokud nebylo „objeveno“, že přenášejí užitečné materiály do zdravých buněk. Kde jsem už tento popis viděl?
Exozomy: přehodnocení jejich role „pytlů na odpadky“
„Před patnácti lety jsme se domnívali, že jednou z fyziologických funkcí exozomů by mohl být proces čištění, při němž by exozomy sloužily jako systém kontroly kvality k ověření ‚recyklovatelnosti‘ membránových molekul.“
„Zpočátku se předpokládalo, že exozomy fungují jako ‚buněčné pytle na odpadky‘, ale nyní jsou tyto extracelulární vezikuly o velikosti nanočástic zkoumány z hlediska jejich role v progresi nemoci a vzniku metastáz.“
„Původně se předpokládalo, že exozomy slouží pouze jako ‚pytle na odpadky‘, do nichž se buňky zbavují nežádoucích složek.“
Tento popis drobných částic, které byly považovány za pytle na odpadky a které zároveň přenášejí informace a náklad mezi buňkami, lze aplikovat jak na exozomy, tak na apoptotická tělíska. Abychom byli spravedliví, obě tyto částice spadají pod širší, zastřešující pojem extracelulární vezikuly. Mezi těmito částicemi je však mnohem více podobností než rozdílů. Uvádí se, že obě spadají do stejné velikostní kategorie (spolu s ektozomy a „viry“) a že pochopení a úplné rozlišení těchto entit na základě jejich rozdílů bylo přehlíženo:
„Existují další typy mikrovezikulů, včetně apoptotických tělísek a ektozomů, které pocházejí z buněk procházejících apoptózou, respektive odlučováním plazmatické membrány. Přestože apoptotická tělíska, ektozomy a exozomy mají všechny zhruba stejnou velikost (obvykle 40-100 nm) a všechny také obsahují cytosol, jedná se o různé druhy vezikul a pochopení rozdílů mezi nimi je nesmírně důležité, ale příliš často je přehlíženo.“
https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-016-0268-z
Tím však výčet podobností nekončí. V článku z ledna 2020 se hovoří o tom, že exozomy jsou ve skutečnosti uvolňovány apoptózou, což ukazuje, že exozomy i apoptotická tělíska vznikají při stejném procesu buněčné smrti. To je další důkaz, že se ve skutečnosti jedná o naprosto stejné částice, jen v různých stádiích a s různými názvy a funkcemi:
„Apoptóza, typ programované buněčné smrti, která hraje klíčovou roli při zdravých i patologických stavech, uvolňuje extracelulární vezikuly, jako jsou apoptotická tělíska a mikrovezikuly, ale uvolňování exozomů v důsledku apoptózy není dosud běžně přijímáno. Zde jsou shrnuty zprávy prokazující přítomnost apoptotických exozomů a jejich roli při zánětu a imunitní odpovědi, spolu s obecným shrnutím apoptózy a extracelulárních vezikulů. Závěrem lze říci, že apoptóza není jen ‚tichým‘ typem buněčné smrti, ale aktivní formou komunikace odumírajících buněk s živými buňkami prostřednictvím exozomů.“
Proč je toto spojení mezi apoptotickými tělísky a exozomy důležité? Vzhledem k tomu, že obojí bylo označeno za pytle na odpadky a považováno za buněčné zbytky/odpad, které vznikají při buněčné smrti, lze vidět, že tyto částice, pokud vůbec něco představují, jsou jen odpadním materiálem z odumírajících buněk, který neslouží žádnému účelu. To dává logicky mnohem větší smysl, než přisuzovat těmto odumřelým částicím funkce, které nelze pozorovat a které je možné vidět jen po procesech, které výrazným způsobem mění vzorek, jako je fixace, dehydratace, barvení a zalití do média, které se používají při přípravě vzorků pro elektronovou mikroskopii.
Chtějí, abyste věřili tomu, že o něco větší kolečko je jiné než kolečka o něco menší.
Je důležité poznamenat, že exozomy, stejně jako „viry“, jsou pravidelně „izolovány“ procesem buněčné kultivace. Mnozí z nás, kteří zpochybňují důkazy o existenci „virů“, tvrdí, že částice pozorované pod elektronovým mikroskopem nejsou s největší pravděpodobností nic jiného než buněčné zbytky vytvořené procesem kultivace. Zatímco je buňka držena mimo tělo v nepřirozených podmínkách, je bombardována antibiotiky, antimykotiky, cizí DNA/materiálem, minimem živin a fyziologicky nevhodnými podmínkami. Po několikadenní inkubaci je buňka obvykle zasypána čerstvou hromadou mnoha dříve uvedených složek a dále inkubována, dokud se nezačne rozpadat. Pozorovaný buněčný rozpad byl sice označen jako cytopatický efekt, ale je součástí procesu buněčné smrti, ze které je viněn neviditelný „virus“. A je skutečností, že právě tento proces kultivace buněk může vést k procesu buněčné smrti známému jako apoptóza:
„Apoptóza je geneticky regulovaný proces, kterým mohou být buňky in vivo eliminovány v reakci na celou řadu fyziologických a toxikologických signálů. U buněk in vitro může být vyvolána buněčná smrt apoptózou, např. vyčerpáním živin nebo faktorů nezbytných pro přežití z kultivačního média.“
Measurement of Apoptosis in Cell Culture | Springer Nature Experiments
Hmmm… ty částice pocházející ze zdravých i apoptotických buněk vypadají podobně… 🤔
Mělo by tedy být zřejmé, že tyto částice, které byly nazvány exozomy, apoptotickými tělísky, extracelulárními vezikuly, „viry“ atd. vznikají právě při procesech destrukce buněk, kterým je buňka vystavena, aby bylo možné tyto částice později najít při zobrazování pomocí elektronového mikroskopu. Nejsou příčinou buněčné smrti, ale jejím důsledkem; jsou výtvorem, který je výsledkem tohoto procesu. Jakmile je vzorek podroben procesům purifikace, jako je ultracentrifugace a ultrafiltrace, větší částice buněčných zbytků jsou rozbity a nakonec rozděleny na menší částice pomocí nepřirozeně vysokých odstředivých sil a různých chemických prostředků. Tyto částice jsou dále pozměněny během přípravy pro zobrazení pomocí elektronového mikroskopu a jsou prezentovány jako mnoho různých entit s různými teoretickými funkcemi připisovanými stejným mrtvým odpadním produktům.
Koncept exozomu
Již víme, že „viry“ vznikly nejprve jako myšlenka na počátku 20. století, jakmile se zjistilo, že bakterie nelze vinit z každé nemoci a že se pravidelně vyskytují i u zdravých jedinců. Předpokládalo se, že v tekutinách způsobujících onemocnění musí být něco menšího než bakterie. Koncept „viru“ vznikl dříve, než byly o existenci této neviditelné entity vůbec předloženy nějaké důkazy. O více než 100 let později stále nemáme žádný přímý důkaz existence „virů“, pouze nepřímé důkazy používané k usuzování na jejich existenci. A tak je to i s exozomy, které také vznikly jako koncept ještě předtím, než byla existence těchto entit nepřímo odvozena:
„Koncept exozomů byl poprvé navržen Tramsem a kol. v roce 1981, přičemž brzy poté byly exozomy identifikovány ve studii o diferenciaci retikulocytů jako důsledek fúze multivezikulárních endozomů s plazmatickou membránou.“
https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijmm.2018.3944#b2-ijmm-43-01-0083
Jelikož mě zaujalo, jak myšlenka exozomů vznikla, rozhodl jsem se rozebrat studii Tramse a kol. z roku 1981, abych viděl, co se mi podaří zjistit. Po přečtení této studie zjistíte, že stejně jako jejich „virové“ protějšky byly částice, o nichž se tvrdí, že jsou exozomy, poprvé vizuálně rozpoznány v tekutinách buněčných kultur. V této studii bylo k hledání částic, které byly nakonec vybrány jako reprezentace pro exozomy, použito mnoho buněčných linií. Patřily mezi ně např.:
- Stabilizované buněčné kultury
- Myší neuroblastomy N-18 a NB41A3
- Krysí gliom, C-6
- Myší melanom, B-16
- Odvozené z embryonální nebo neonatální tkáně jako primární kultury
- Krysí aorta, RA-B
- Myší astroblast, D-34
- Vypěstované z bioptického materiálu
- Lidský melanom, CL
- Fibroblasty lidské předkožky, KIN
Vědci si všimli, že při studiu dvou enzymů, ekto-ATPázy a ekto-5′-nukleotidázy, se tyto enzymy uvolňovaly do superfuzního média kultivovaných buněčných linií. Vzhledem k měření těchto dvou enzymů v médiích kultivovaných buněk se vědci rozhodli hledat příčinu. Přistoupili k pasážování mnoha buněčných linií a pravidelně testovali hladiny enzymů. Nakonec vědci superfuzní médium přefiltrovali a zkoumali pomocí elektronového mikroskopu. Po fixaci pelet v pufrovaném glutaraldehydu objevili dvě skupiny vezikulů; jedna se skládala z nepravidelně tvarovaných vezikulů o průměru přibližně 500 až 1 000 nm a druhá skupina v rámci větších vezikulů představovala skupinu menších, kulovitých vezikulů o průměrné velikosti přibližně 40 nm. Věci poté určili, že tyto částice jsou příčinou zjištěné enzymatické aktivity, aniž by to kdy přímo prokázali pomocí vědecké metody.
Zajímavé je, že po nálezu těchto různých částic vědci připustili, že by se mohlo jednat o fragmenty z odumírajících lyzovaných buněk. Lýza je rozpad buněčné membrány, který je údajně způsoben „virovými“, enzymatickými nebo osmotickými mechanismy. Jinými slovy, tyto částice označené jako exozomy pravděpodobně vznikly stejným procesem, při němž vznikají „virové“ částice při rozpadu buňky, a také procesem, při němž se uvolňují apoptotická tělíska, když buňka odumírá v důsledku apoptózy. To znamená, že exozomy, „viry“, apoptotická tělíska atd. jsou tytéž částice uvolněné při odumírání buňky po vystavení toxickým podmínkám, jako je kultivace buněk pro experimenty. Různí vědci jim pouze dali různá jména a funkce.
Trams a kol. se pokusili na základě nepřímých rozdílů ve složení založených na enzymatických hodnotách nepurifikovaných preparátů prokázat, že tyto částice nejsou produktem lyzovaných buněk. Připustili však, že jejich menší částice se podobají vezikulům „purifikovaným“ z mozku prasete nebo z telete, z mozku krysy a králíka, zatímco některé malé vezikuly s hustším stínem se podobají „virovým“ částicím typu C. Jinými slovy, exozomy se podobaly „virům“ (které pocházejí z lyzovaných buněk) a přesně ty samé částice se nacházely všude, nejen ve studiích virologů. Tyto částice byly nalezeny ve zcela zdravých buněčných liniích a v kulturách, které neobsahovaly vůbec žádný „virový“ materiál. Kupodivu, když se vědci pokusili najít tytéž částice v krvi, dospěli k závěru, že neexistuje žádný spolehlivý důkaz, že by se v krevním oběhu vyskytovaly mikrovezikuly odvozené z plazmatické membrány. Vzhledem k tomu, že výsledky pocházely pouze z procesu kultivace buněk, vědci si položili otázku, zda vylučování mikrovezikul a jejich interakce s cílovou buňkou nebo cílovým orgánem představuje fyziologický jev, který probíhá in vivo (tj. v živém organismu)?
Je zřejmé, že toto odhalení nálezu „virových“ částic ve zdravých kulturách by znamenalo konec pro techniku buněčné kultivace používanou v případě „virů“ (přestože John Franklin Enders přiznal, že našel částice „viru“ spalniček v kulturách z materiálu, který z případu se spalničkami nepocházel). Tento typ studie ve skutečnosti ukazuje, že částice „podobné virům“ se nacházejí v buněčných kulturách bez „virového“ materiálu, a slouží tak jako určitý druh kontroly pro virologii, kterou virologie pravidelně ignoruje. K takovému odhalení samozřejmě nemohlo dojít, takže tyto částice musely být něčím novým. I když nebyl předložen žádný důkaz o fungování těchto částic, byla stanovena hypotéza. Vědci došli k závěru, že na mezibuněčném transportu některých trofických látek nebo živin by se mohly podílet takové prostředky, jako jsou mikrovezikuly, které získali ze superfuzních médií buněčných kultur. Protože by to tak mohlo být, rozhodli se tyto částice označovat spíše jako exozomy než jako „viry“. Tak se zrodil koncept exozomů.
Pozn. překl.: Článek je dále uveden ve zkrácené podobě. Místo citací dlouhých pasáží ze studie E. G. Tramse a kol. z roku 1981 je uvedeno pouze shrnutí studie, které jinak bývá standardně uváděno na konci článků autora Mikea Stonea. Zde je uveden odkaz na studii E. G. Tramse a kol. v případě zájmu o dohledání bližších informací: Exfoliation of membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles.
- Kultury z různých normálních a neoplastických buněčných linií uvolňovaly vezikuly s 5′-nukleotidázovou aktivitou, která odpovídala ektoenzymové aktivitě mateřské jednovrstvé kultury (monolayeru).
- Vyšetření pomocí elektronové mikroskopie ukázalo, že vezikuly měly průměrnou velikost 500 až 1 000 nm a často obsahovaly druhou skupinu vezikulů o průměru asi 40 nm.
- Uvolněné membránové vezikuly mohou plnit fyziologickou funkci; navrhujeme, aby byly označeny jako exozomy.
- Jinými slovy, částice pocházely z buněčných kultur a jejich velikost se pohybovala od 40 do 1000 nm, což ukazuje, že se nejedná o purifikované preparáty jedné látky.
- Během zkoumání funkční role dvou ektoenzymů vědci uvedli, že „pozorovali“, že se ATPáza a 5′-nukleotidáza uvolňovaly do superfuzního média kultivovaných buněčných linií.
- Tvrdili, že zjistili, že toto uvolňování nebylo způsobeno cytolýzou (rozpadem nebo narušením buněk, zejména vnějším činitelem) odumírajících buněk.
- Enzymy byly uvolňovány ve formě vezikulů, které pravděpodobně pocházely ze specifických domén plazmatické membrány.
- Nebylo zjištěno, zda uvolněné mikrovezikuly zprostředkovávají fyziologické procesy in vivo (v živém organismu).
- Jinými slovy, vědci našli částice v rozsahu velikosti „virů“, o nichž rozhodli, že nejsou produktem rozpadu buněk patologickými procesy, a předpokládali, že jsou jiné a že zajišťují funkce, aniž by to přímo prokázali.
- Buněčné linie použité v této studii byly následující:
- Stabilizované buněčné kultury
- Myší neuroblastomy N-18 a NB41A3
- Krysí gliom, C-6
- Myší melanom, B-16
- Odvozené z embryonální nebo neonatální tkáně jako primární kultury
- Krysí aorta, RA-B
- Myší astroblast, D-34
- Vypěstované z bioptického materiálu
- Lidský melanom, CL
- Fibroblasty lidské předkožky, KIN
- Stabilizované buněčné kultury
- Buňky byly pěstovány v příslušném médiu v jedné vrstvě (monolayeru) v plastových nádobách o velikosti 75 cm2.
- Čísla pasáží u kultur označují, kolikrát byla zásobní buněčná linie subkultivována trypsinizací, ředěním a explantací do udržovacích nebo experimentálních kultivačních nádob.
- Během opakované pasáže buněčné linie krysího gliomu C-6 vědci pozorovali v průběhu několika let, že aktivita ekto-5′-nukleotidázy prudce klesla asi po 20 pasážích a že aktivita ekto-ATPázy se zvýšila.
- Kompletní růstová média pro tkáňové kultury obvykle obsahují stopy ATPázy a 5′-nukleotidázy pocházející ze složky fetálního telecího séra.
- Proto byly kultury před každým experimentem několikrát promyty modifikovaným médiem bez séra a rutinní inkubace byly prováděny v médiu bez séra.
- Pro modifikovaná média, která byla aplikována na konfluentní kultury monolayeru, v nichž byla měřena akumulace enzymů, vědci použili termín superfuzní média.
- Vědci zjistili, že 5′-nukleotidáza a ATPáza byly uvolněny do bezsérového (superfuzního) média kultur monolayerů normálních a neoplastických buněk.
- Uvolňování 5′-nukleotidázové aktivity do superfuzního média za 24 hodin se pohybovalo od 2% do 70% naměřené aktivity ekto-5′-nukleotidázy monolayeru a bylo charakteristické pro konkrétní buněčnou linii a číslo pasáže.
- S rostoucím počtem pasáží se u několika buněčných linií změnil poměr aktivity ekto-5′-nukleotidázy a ekto-ATPázy a změnilo se také množství enzymů uvolněných do superfuzních médií.
- Zatímco duplicita měření byla uspokojivá, pokud byla měření provedena v rozmezí několika dnů nebo několika pasáží, srovnání provedená s odstupem několika měsíců nebylo možné statisticky zpracovat.
- Jinými slovy, výsledky přímo souvisely s použitou buněčnou linií a počtem provedených pasáží a duplicita měření nebyla po několika měsících uspokojivá.
- Rychlost uvolňování enzymu se významně nezměnila (tj. došlo ke změně) úpravou koncentrace fetálního telecího séra v médiu (0 až 20%) nebo přidáním 0,5% trypsinu do média.
- Uvolňování aktivity 5′-nukleotidázy do superfuzního média bylo pozměněno několika sloučeninami.
- Je tedy vidět, že přidání sloučenin může změnit získané výsledky.
- ATPázová aktivita sedimentovaných částic klesala rychleji než aktivita 5′-nukleotidázy, což naznačuje, že populace částic nebyla homogenní (tj. jednalo se o smíšenou populaci různých částic).
- Elektronová mikroskopie po fixaci pelet v pufrovaném glutaraldehydu odhalila dvě skupiny vezikulů:
- Jedna z nich se skládala z vezikulů nepravidelného tvaru o průměru přibližně 500 až 1000 nm.
- Uvnitř těchto vezikulů se nacházela další populace menších, kulovitých vezikulů o průměrné velikosti přibližně 40 nm.
- Pro vaši informaci: uvádí se, že exozomy mají velikost od 30 do 150 nm, což znamená, že se nejednalo o striktně předpokládané exozomy ve směsi, tj. nejednalo se o purifikaci/izolaci.
- Je možné, že vezikuly byly fragmenty z odumírajících lyzovaných buněk, ale vědci tento závěr vyloučili na základě toho, že při uvolnění až 70% aktivity 5′-nukleotidázy ze zdravé kultury monolayeru za 24 hodin by prý došlo k nahromadění mnoha dalších subcelulárních fragmentů.
- Vědci hledali rozdíly ve složení, aby poskytli další důkaz, že uvolněné vezikuly nepocházely z lyzovaných buněk (jak by se však bez purifikace a izolace částic zjistily rozdíly ve složení…?).
- To, že vezikuly pocházely z plazmatické membrány příslušných buněčných linií monolayeru, naznačovalo pozorování, že specifické aktivity enzymů mikrovezikulů a enzymů monolayeru byly zhruba řádově stejné.
- Vědci tvrdí, že jak 5′-nukleotidáza, tak ATPáza jsou údajně klasické markerové enzymy plazmatické membrány, ale zachování ATPázy v procesu uvolňování vezikulů silně naznačovalo, že mikrovezikuly byly odvozeny ze specifických domén plazmatické membrány.
- Morfologická podobnost uvolněných vezikulů s preparáty synaptosomů naznačovala jejich možnou transportní funkci (tzn. částice vypadaly stejně jako částice nalezené v kulturách z mozku).
- Pracovní hypotéza byla, že jedna nebo více ektofosfoesterových hydroláz by mohla hrát roli v procesu rozpoznávání a/nebo transportu.
- K ověření této hypotézy vědci provedli dva experimenty a dospěli k závěru, že v současné době nemají důkazy, které by prokázaly, že zvýšené uvolňování 32P v přítomnosti vezikulů je způsobeno pouze defosforylací povrchových složek buněk, ale domnívali se, že experimenty naznačují, že došlo k určité interakci mezi buňkami monolayeru a vezikuly.
- Vzhledem k tomu, že k uvolňování mikrovezikulů docházelo u všech studovaných buněčných liniích, vědci provedli několik předběžných testů na jejich přítomnost v krevním oběhu.
- Předpokládali, že přítomnost těchto vezikulů by byla rozpoznatelná podle jejich enzymové aktivity po filtraci nebo centrifugaci krevní plazmy.
- Po testování dospěli k závěru, že neexistuje žádný přesvědčivý důkaz, že v krevním oběhu jsou přítomny mikrovezikuly odvozené od plazmatické membrány.
- Vědci se domnívali, že jejich pozorování naznačují, že k uvolňování membránových vezikulů by mohlo docházet u mnoha různých normálních i neoplastických buněk.
- Tvrdili, že předložili důkaz, že mikrovezikuly získané ze superfuzních médií tkáňových kultur nejsou pouhými fragmenty z cytolýzy odumírajících buněk (což připouštěli jako možnost).
- Přednostní uvolňování ekto-5′-nukleotidázy z plazmatické membrány před ekto-ATPázou dále naznačovalo, že proces uvolňování mikrovezikulů byl selektivní a že mikrovezikuly se skládaly ze specifických domén plazmatické membrány.
- Elektronmikroskopické snímky částic ze superfuzních médií z kultur krysích gliomů naznačovaly, že větší membrány pocházely z cytoplazmatické membrány.
- Menší skupina vezikulů měla jistou podobnost s vezikuly purifikovanými z mozku prasete nebo z telete, z mozku krysy a králíka, zatímco některé malé vezikuly s hustším stínem se podobaly „virovým“ částicím typu C.
- Jinými slovy, vědci našli přesně ty samé částice, jaké se vyskytují v kulturách mozků zvířat, stejně jako „viry“, ale přiřadili jim jiný název a funkci na základě nepřímých chemických výsledků ze smíšených nepurifikovaných preparátů pocházejících z buněčných kultur.
- Defosforylace, pravděpodobně povrchových složek monolayeru mikrovezikulárními ektofosfoesterhydrolázami, naznačovala interakci mezi vezikuly a buňkami.
- Vědci uvedli, že je třeba si položit otázku, zda vylučování mikrovezikulů a jejich interakce s cílovou buňkou nebo cílovým orgánem představuje fyziologický jev, který probíhá in vivo?
- Jinými slovy, nevěděli, zda proces, který vytvořili ve své kultivační polévce, skutečně probíhá v živém organismu.
- Je také představitelné (tzn. je možné si to představit), že vezikul může být zčásti nebo zcela začleněn do přijímající buňky, čímž dojde k modifikaci hostitelské buňky (to zní jako „virus“…).
- Je představitelné, že fyziologická distribuce některých buněčných produktů mezi buňkami nebo orgány probíhá podobným způsobem, tj. jsou zabaleny a opatřeny adresou, a nikoliv pouze rozptýleny prostřednictvím složek extracelulární tekutiny.
- Mezibuněčný transport některých trofických látek nebo živin by mohl zahrnovat takové prostředky, jako jsou mikrovezikuly, které byly získány ze superfuzních médií buněčných kultur.
- V předběžné zprávě vědci navrhli, že takové vezikuly odvozené z plazmatické membrány by mohly být obecně označeny jako exozomy.
Zdá se, že „viry“ a extracelulární vezikuly jsou si až nápadně podobné. 🤔
„Vzhledem k tomu, že se vezikuly podobají virům, je samozřejmě otázkou, zda první extracelulární vezikuly byly primitivními viry a viry se učily od extracelulárních vezikulů, nebo naopak.“
„Viry se mohou replikovat, na rozdíl od vezikulů. Mezi nimi však existuje mnoho variant. Kde začínají viry a kde začínají extracelulární vezikuly?“
Leonid Margolis, virologhttps://www.quantamagazine.org/cells-talk-in-a-language-that-looks-like-viruses-20180502/
Při nahrazování jedné podvodné teorie za jinou musíme být opatrní. Mnozí se bohužel do této pasti chytili, když zahodili koncept „viru“ a nahradili ho konceptem exozomu. Neuvědomují si, že tyto dva koncepty jsou postaveny na stejném podvodném základu. Oba jsou spojeny s procesem kultivace buněk a pocházejí ze stejné buněčné smrti iniciované toxickým zatížením. To je důvod, proč mají vědci problém od sebe oddělit nejen částice, ale i jejich teoretické fungování. Když se lži příliš zkomplikují, začnou se vzájemně proplétat a iluze se začne rozpadat.
Ať už je chcete nazývat jakkoli, rozpadlé buněčné zbytky známé jako exozomy, „viry“, apoptotická tělíska, extracelulární vezikuly atd. jsou všechno ty samé částice stejné velikosti, hustoty a morfologie. Jsou jim přiřazovány různé názvy a funkce na základě toho, jací vědci je zkoumají. I když se tvrdí, že jde o samostatné entity, částice nelze purifikovat a izolovat od všeho ostatního, aby je bylo možné nezávisle studovat a charakterizovat. Jejich fungování nelze pozorovat v živém organismu, a tak jsou stejným částicím přiřazovány teoretické role v těle v závislosti na vědcích provádějících experimenty. U žádné z těchto částic nebylo splněno důkazní břemeno tím, že by byly prokázány na základě přísného testování a dodržování vědecké metody. Jelikož je nikdy nelze pozorovat v přírodě a musí být vytvořeny, aby mohly být „pozorovány“, nesplňují hned první kritérium. Jelikož je nelze oddělit, selhávají jako platná nezávislá proměnná. Bez platné nezávislé proměnné nelze určit příčinu a následek. To znamená, že na tyto částice nelze aplikovat a ani se neaplikuje vědecká metoda. Všechny nepřímé důkazy nashromážděné pro tento buněčný odpad, který je považován za různé entity, tak nejsou ničím jiným než pseudovědeckými pohádkami.
